活性氧响应的纳米颗粒对炎性环境下牙龈成纤维细胞功能的影响及机制

目的 探讨在牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Porphyromonas gingivalis-lipopolysaccharide,P.g-LPS)诱导的牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,HGFs)炎症环境下,活性氧(reactive oxygen species,ROS)响应型纳米颗粒PssL-NAC对HGFs内ROS、炎症因子、胶原蛋白生成、细胞迁移功能以及Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)-核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)通路蛋白表达的影响.方法 本研究已通过单位伦理委员会审查批准.通过响应ROS的硫缩酮键(thioketal,TK)连接聚己内酯(polycaprolactone,PCL)的疏水端和聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)的亲水端,水相油相自主装的方式得到内部包裹油溶性的抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine-NAC)的PssL-NAC微球,制备NAC水溶液,并使用透射电镜观察验证纳米粒子合成成功.在提取的HGFs中分别加入P.g-LPS(0、5、10μg/mL),P.g-LPS(0、5、10μg/mL)+NAC,P.g-LPS(0、5、10μg/mL)+PssL-NAC,共聚焦显微镜观察不同组别细胞内ROS水平,确定后续实验使用的P.g-LPS浓度.将HGFs随机分为空白对照组(对照组,不做处理),P.g-LPS组(P.g-LPS处理细胞),NAC组(P.g-LPS+NAC处理细胞),PssL-NAC组(P.g-LPS+PssL-NAC处理细胞).通过细胞增殖与毒性实验验证PssL-NAC的生物安全性.使用2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐探针与细胞共孵育通过荧光实时定量检测细胞内炎症因子白细胞介素6(inter-leukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和Ⅰ型胶原蛋白(collagen 1,COL1)、Ⅲ型胶原蛋白(collagen 3,COL3)的基因水平;通过划痕实验观察PssL-NAC对牙龈成纤维细胞的迁移功能的影响;通过免疫印迹法检测TLR4-NFκB信号通路相关蛋白的表达.结果 PssL-NAC具有良好生物相容性,对HGFs的细胞增殖能力无显著影响(P>0.05);在P.g-LPS浓度升高的条件下,PssL-NAC能维持细胞内大约两倍对照组的ROS水平(P<0.001);PssL-NAC能显著降低P.g-LPS诱导升高的IL-6(P<0.001)、TNF-α基因水平(P<0.001),上调COL1基因水平(P<0.001);P.g-LPS刺激后,PssL-NAC能将细胞迁移能力恢复至对照组水平(P>0.05),并降低TLR4-NF-κB通路中TLR4(P<0.001)、p65(P=0.006)、p-p65(P=0.017)蛋白的表达.结论 PssL-NAC维持细胞内适宜浓度ROS,通过TLR4-NF-κB通路减轻P.g-LPS诱导的细胞炎症,并恢复炎症条件下的细胞胶原生成和细胞迁移功能.