登革病毒NS2B-NS3蛋白酶在大肠埃希菌中表达条件的优化及酶活性测定

目的 在大肠埃希菌(E.coli)中表达登革病毒(dengue virus,DENV)NS2B-NS3蛋白酶,对表达条件进行优化,并测定酶活性,为抗DENV药物先导化合物的筛选与发现奠定基础.方法 将密码子优化的NS2B-NS3基因连接到pET-28a载体中,构建重组原核表达质粒pET-28a-NS2B-NS3,转化至E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中,IPTG诱导NS2B-NS3蛋白酶表达.通过优化诱导时间、诱导温度和IPTG诱导浓度,确定NS2B-NS3蛋白酶在E.coli中的最佳表达条件.使用HisTrapTM亲和层析柱分离纯化NS2B-NS3蛋白酶,通过荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)试验测定酶活性.结果 重组原核表达质粒pET-28a-NS2B-NS3经双酶切(Nhe Ⅰ/Xho Ⅰ)及测序证明构建正确.NS2B-NS3蛋白酶在E.coli中的最佳表达条件为:诱导温度20℃,诱导时间10 h,IPTG浓度0.2 mmol/L,表达量达20 mg/L.纯化的NS2B-NS3蛋白酶纯度大于90％,可与小鼠抗His-tag单克隆抗体特异性结合,且具有良好的水解活性,其比活力为16 111 U/mg、米氏常数(Km)值为16.46 μmol/L、催化常数(kcat)值为0.028/s.结论 成功制备了高纯度、高活性的DENV NS2B-NS3蛋白酶,为NS2B-NS3蛋白酶抑制剂高通量筛选模型的建立奠定了实验基础.