Method of increasing the efficiency of obtaining recombinant nodular dermatitis viruses for the development of vector vaccines

Поксвирусы широко используются в качестве векторов при разработке вакцин против инфекционных заболеваний человека и животных. Ограниченный круг восприимчивых животных и непатогенность для человека каприпоксвирусов определяют огромный потенциал их использования в качестве вакцинных векторов. Технология получения рекомбинантных каприпоксвирусов может быть значительно улучшена путем сочетания временной доминантной селекции по гену gpt Escherichia coli (основан на устойчивости к микофеноловой кислоте) с дифференциальной экспрессией флуоресцентного белка. Рекомбинантный вирус генерируется путем замены зеленого флуоресцирующего белка (в акцепторном вирусе) целевым геном в результате двух последовательных рекомбинаций ДНК. В процессе первого кроссинговера плазмида интеграции с целевым геном встраивается в геном акцепторного вируса. В результате образуется нестабильная генетическая конструкция, которая может существовать только под селективным давлением микофеноловой кислоты. После снятия селективного давления происходит внутримолекулярная рекомбинация вирусного генома в участках гомологии, и образуются два типа вирусов: рекомбинант с целевым геном и исходный акцепторный вирус. Вовлеченные вирусы (зеленый исходный, зеленый промежуточный и бесцветный конечный) визуализируются по-разному с помощью флуоресцентной микроскопии, что позволяет использовать простой и эффективный протокол отбора целевых рекомбинантов. Этот метод (замена генов «от зеленого к бесцветному») значительно сокращает время, необходимое для получения безмаркерного рекомбинантного каприпоксвируса. Poxviruses are widely used as vectors in the development of vaccines against infectious diseases in humans and animals. The limited range of susceptible animals and the non-pathogenicity of capripoxviruses to humans determine the great potential for their use as vaccine vectors. The technology for producing recombinant capripoxviruses can be greatly improved by combining transient dominant selection for the gpt gene of Escherichia coli (based on resistance to mycophenolic acid) with differential expression of green fluorescent protein. The recombinant virus is generated by replacing the green fluorescent protein (in the acceptor virus) with the target gene by two consecutive DNA recombinations. During the first crossover, the integration plasmid with the target gene is inserted into the genome of the acceptor virus. As a result, an unstable genetic construct is formed, which can only exist under the selective pressure of mycophenolic acid. After the selective pressure is removed, intramolecular recombination of the viral genome occurs in homology regions, and two types of viruses are formed: a recombinant with a target gene and an initial acceptor virus. The viruses involved (green parent, green intermediate, and colorless final) are visualized differently by fluorescence microscopy, allowing for a simple and efficient protocol for selecting target recombinants. This method (replacement of genes "from green to colorless") significantly reduces the time required to obtain a marker-free recombinant capripoxvirus.