甲型H5N1流感病毒神经氨酸酶生物信息学分析及其原核表达和免疫原性评价

目的 分析甲型H5N1流感病毒(简称H5N1)神经氨酸酶(neuraminidase,NA)生物信息学特征,原核表达获得H5N1 NA重组蛋白,并在动物模型中评价其免疫原性.方法 利用生物信息学软件分析H5N1 NA的理化性质、跨膜区、信号肽以及二级结构和高级结构.将H5N1 NA的编码区进行密码子优化后基因合成,将合成目的基因片段与pET-22b(+)连接,构建重组原核表达质粒pET-22b(+)-H5N1 NA,将重组质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞并进行诱导表达;超声破碎菌体,使用Ni-NTA亲和层析纯化,梯度透析复性,SDS-PAGE分析纯度,Bradford法测定浓度;分别用5、10和50μg的NA加或不加MF59佐剂免疫BALB/c小鼠,检测其诱导产生NA特异性抗体滴度,评价免疫原性.结果 经一系列生物信息学软件分析得知,H5N1 NA为稳定的亲水性跨膜蛋白,无信号肽,二级结构以无规则卷曲和α螺旋为主,高级结构为四聚体结构,相对分子质量48 941.92,分子式C2148H3293N595O666S26,等电点6.13,不稳定系数31.84,总平均亲水性-0.268;经双酶切和测序验证,重组质粒pET-22b(+)-H5N1 NA构建成功,转化至E.coliBL21(DE3),经诱导表达、纯化、复性、浓缩获得重组NA纯度为94％,相对质量浓度为620.23 μg/mL,具有酶活性;使用该原核表达的NA免疫BALB/c小鼠,能产生结合H5N1疫苗原液中NA的特异性抗体,50 μg+MF59佐剂组平均效价达3 520.结论 原核表达的NA免疫小鼠诱导产生的抗体能够与甲型H5N1流感病毒天然的NA发生反应,为基于NA的流感重组亚单位疫苗研发提供了可行路径.