结核分枝杆菌乙酰转移酶fadA3对宿主蛋白乙酰化修饰及其体内存活影响的研究

目的:探讨结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)乙酰转移酶fadA3对宿主蛋白乙酰化修饰、基因表达和MTB在体内存活的影响.方法:从首都医科大学附属北京胸科医院/北京市结核病胸部肿瘤研究所分子生物学实验室选取MTB标准株(H37Rv),利用CRISPR-cas系统辅助的非同源性末端接合技术(CRISPR-NHEJ)构建H37Rv-fadA3基因敲除株(△fadA3),利用微孔板法分别检测H37Rv和△fadA3在7H9液体培养基中的吸光度值(A值)和细菌活性,绘制生长曲线图和最低抑菌浓度表.运用免疫印迹和转录组学测序分析H37Rv和△fadA3感染巨噬细胞(巨噬细胞系THP-1分化得到)后蛋白质乙酰化修饰变化及基因表达的差异情况;采用菌落计数和苏木精-伊红染色法分析H37Rv和△fadA3在C57BL/6J小鼠肺组织和巨噬细胞中的存活及病理变化.结果:fadA3经敲除1116 bp片段后成功获得△fadA3敲除株.H37Rv和△fadA3在培养第3、6、9和12天的Aeoo值(分别为 0.245±0.005 和 0.232+0.013、0.403+0.122 和 0.385±0.009、0.444±0.010 和 0.442+0.005、0.675±0.027 和 0.662±0.026)差异均无统计学意义(t 值分别为 1.623、2.351、0.178、0.848,P 值均＞0.05);二者对异烟肼、乙胺丁醇、链霉素、左氧氟沙星、PA-824、利奈唑胺、氯法齐明、利福平、贝达喹啉、德拉马尼等一线/二线抗结核药物的 90％最低抑菌浓度相同(分别为 0.006、2.000、0.313、0.156、0.250、0.625、1.250,0.003、0.125、0.320μg/ml).H37Rv感染巨噬细胞中全蛋白乙酰化修饰灰度值(243.100±7.125)与未感染组(204.800±9.348)和△fadA3 感染组(154.500±14.890)的差异均有统计学意义(t=5.294,P=0.013;t=9.350,P=0.003)0与H37Rv相比,△fadA3感染上调的差异基因有94个,下调有7个.同时,在巨噬细胞模型(72 h)和小鼠肺组织中(28 d),H37Rv感染后的菌落形成单位计数[分别为(41.000±4.583)X10和log10(5.531±0.203)]与△fadA3感染[(18.670+1.155)X104 和 log10(4.541+0.276)]的差异均有统计学意义(t=8.815,P=0.001;t=6.466,P＜0.001);△fadA3感染小鼠肺组织病理炎症性浸润较H37Rv感染小鼠明显减弱.结论:抗结核药物对△fadA3敲除株与H37Rv的杀菌效果一致.fadA3可显著调控宿主蛋白乙酰化修饰和基因表达,可能是维持H37Rv在巨噬细胞胞内和小鼠肺组织中存活,并导致肺组织炎症性浸润的重要毒力因子.这些发现将为靶向fadA3和宿主蛋白乙酰化的宿主导向治疗提供理论数据.