Tinh sạch phức hợp Rave từ Saccharomyces cerevisiae bằng việc sử dụng FLAG tag

RAVE (Regulator of the H + -ATPase of the Vacuolar and Endosomal membranes) la một nhân tố cần thiết cho qua trinh lắp rap va tai lắp rap của V-ATPase. Phức hợp RAVE co ba tiểu đơn vị đo la: Rav1p, Rav2p va Skp1p. Hiện nay co rất it những nghien cứu về phức hợp RAVE. Vi vậy việc nghien cứu cấu truc của phức hợp RAVE la rất quan trọng để hiểu ro về qua trinh điều hoa sự lắp rap cũng như la tai lắp rap của V-ATPase. Trong nghien cứu nay, phức hợp RAVE được tinh sạch bằng ai lực, dựa vao việc gắn FLAG tag vao tiểu đơn vị Rav1p hoặc la Rav2p. Qua trinh thi nghiệm: Tế bao nấm men được nuoi trong 8 lit moi trường lỏng YEPD ở 30 o C, lắc ở 200 rpm, cho đến khi OD 600nm khoảng 3. Sau đo tế bao sẽ được pha vỡ bằng thiết bị French pressure cell disruptor ở 25000 p.s.i trong đệm TBSE (50 mM Tris/Cl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4) với 1 mM PMSF. Dịch tế bao sau khi được pha vỡ sẽ được ly tâm ở 20000 xg trong 20 phut ở 4 o C. Tiếp theo, toan bộ dịch nổi được chạy qua cột sắc ký co chứa 1 ml anti-FLAG M2 gel. Sau khi rửa cột anti-FLAG với đệm TBSE, phức hợp RAVE sẽ được rửa giải với đệm TBSE co chứa 100 µg/ml FLAG peptides. Kết quả thu được chỉ ra rằng, việc tinh sạch phức hợp RAVE bằng cach gắn FLAG tag vao đầu C của dưới đơn vị Rav2 từ nấm men S. cerevisiae tốt hơn la khi tinh sạch phức hợp RAVE bằng cach gắn FLAG tag vao đầu N hoặc đầu C của dưới đơn vị Rav1