外源性马立克氏病病毒荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]为解决现有兽用生物制品外源性马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)检验方法灵敏度低、检测时间长、鉴别性不强的问题,研究分别建立MDV血清1 型(MDV serotype 1,MDV 1)和MDV 血清3 型(MDV serotype 3,MDV 3)毒株的实时荧光定量PCR检测方法,用于禽用生物制品纯净性控制.[方法]从NCBI 下载MDV 1、MDV 血清2 型(MDV serotype 1,MDV 2)和MDV 3各毒株UL19序列,进行核苷酸和氨基酸序列比对分析;分别针对MDV 1 CVI988 毒株、MDV 3 FC126 毒株的UL19设计特异性引物和相应的Taqman探针,建立实时荧光定量PCR检测方法;分别构建相应的重组质粒作为阳性标准品,建立标准曲线,并评价所建立方法基因拷贝数检测的灵敏度;分别对其他禽用病毒类生物制品、毒种、MDV 2 SB-1毒株UL19的全长质粒及生产原材料(SPF 鸡胚尿囊液、胚体、尿囊膜、鸡胚成纤维细胞)进行检测,评价检测方法的特异性;分别对600、60、6、0.6、0.06、0.006、0.0006 PFU 的CVI988 毒株和FC12 6 毒株进行检测,评价所建立方法检测活病毒粒子的灵敏度;分别以不同稀释度的阳性标准品质粒为模板,进行3 次重复性检测,计算变异系数,分析所建立检测方法的可重复性.[结果]MDV UL19在同一血清型内核苷酸和推导的氨基酸同源性达99.99％,具有很高的保守性,在不同血清型间核苷酸同源性只有约75％,推导的氨基酸同源性只有约85％;分别建立了MDV 1 和MDV 3 两种实时荧光定量PCR检测方法;MDV 1 检测方法标准曲线的扩增效率E=98.8％,相关系数R2=0.992,标准曲线方程Y=-3.351X+38.828(Y=Ct,X=lg(拷贝数)),MDV 3检测方法标准曲线的扩增效率E=95.0％,相关系数R2=0.998,标准曲线方程Y=-3.447X+36.496(Y=Ct,X=lg(拷贝数));所建立的两种检测方法特异性好,MDV 1 或MDV 3 毒株扩增曲线良好,其他禽用病毒类生物制品、毒种、MDV 2 SB-1 毒株UL19的全长质粒及生产原材料未出现特异性扩增曲线;灵敏度高,MDV 1 基因拷贝数检出限度为32.8 拷贝/μL,至少可检出0.006 PFU 的CVI988 毒株,MDV 3基因拷贝数检出限度为10 拷贝/μL,至少可检出0.006 PFU 的FC126 毒株;重复性好,MDV 1 检测方法重复性试验的变异系数小于1％,MDV 3检测方法重复性试验的变异系数小于1.5％.[结论]所建立的实时荧光定量PCR检测方法可分别用于禽用生物制品中外源性MDV1、MDV3毒株的检测.