巴马小型猪ABCD4基因序列分析、真核表达载体构建及组织表达分析

[目的]获取巴马小型猪ATP结合盒D亚科成员4(ATP binding cassette subfamily D member 4,ABCD4)基因CDS区序列并预测其编码蛋白的结构功能,构建真核表达载体,了解ABCD4基因在巴马小型猪中的组织分布情况,为探究ABC D4基因对巴马小型猪生长发育的作用提供理论和分子基础.[方法]以巴马小型猪皮下脂肪组织cDNA为模板,利用RT-PCR对A BCD4基因CDS区进行扩增、测序,利用生物信息学分析软件对巴马小型猪ABCD4基因CDS区序列与不同物种比对,构建系统进化树,并对ABCD4蛋白的理化性质、跨膜结构等进行预测.将获得的目的基因连接至pEGFP-N1载体并转染到IPEC-J2细胞,检测转染后荧光和基因表达量变化.通过实时荧光定量PCR检测巴马小型猪各组织A BCD4基因表达量.[结果]巴马小型猪ABCD4基因CDS区全长1 818 bp,编码605个氨基酸,与Ensembl上猪参考序列(ENSSSCT00000037529)的相似性为99.7％,存在6处碱基突变和1处碱基插入.相似性比对发现,猪和人、原鸡、倭黑猩猩、马、双峰驼、牛ABCD4序列的相似性分别为87.6％、72.7％、87.6％、91.7％、88.1％和88.6％.系统进化树显示,猪与马亲缘关系最近,与原鸡亲缘关系最远.生物信息学分析显示,ABCD4蛋白分子质量为68.66 ku,理论等电点(pI)为7.13,存在5个跨膜螺旋结构,无信号肽,属于跨膜蛋白;存在58个磷酸化位点和10个N-糖基化位点;二级结构中α-螺旋、β-转角、无规则卷曲、延伸链占比分别为50.91％、3.64％、28.43％和17.02％.细胞转染试验结果显示,转染30 h后重组质粒组和空载体对照组均有荧光出现,且转染重组质粒的细胞内ABCD4基因表达量极显著高于空载体对照组(P＜0.01).实时荧光定量PCR结果显示,ABCD4基因在巴马小型猪皮下脂肪中表达量最高,显著高于其他组织(P＜0.05);在心脏中表达量最低.[结论]本试验成功扩增获得巴马小型猪ABCD4基因CDS区序列,ABCD4蛋白是一种疏水性跨膜蛋白,主要在巴马小型猪皮下脂肪中表达.本试验结果为探究A BCD4基因对猪背膘厚的影响提供了分子依据.