基于CRISPR/CasX介导的水稻基因组编辑技术的建立

Cas蛋白作为核酸酶发挥其切割活性需要识别特定的PAM序列,如SpCas9 识别NGG PAM位点,LbCas12a识别TTTV PAM.已挖掘到新的能够识别TTCN PAM序列的蛋白—CasX蛋白,扩展了基因组编辑技术的编辑范围.本研究利用CasX的两个衍生型蛋白PlmCasX和DpbCasX,建立基于CRISPR/CasX介导的水稻基因编辑系统.通过PEG介导的水稻原生质体瞬时表达分析其编辑活性发现,PlmCasX和DpbCasX两个蛋白能够对水稻内源基因OsCPK16 实现有效编辑.后通过水稻稳定遗传转化进一步验证,在TTCA PAM识别位点,DpbCasX蛋白对水稻内源基因OsCPK21 的编辑效率为 17.5%,PlmCasX蛋白对水稻内源基因OsCPK21 的编辑效率为 66.07%;在TTCG PAM识别位点,PlmCasX蛋白对OsCPK4 的编辑效率为 23.21%,而DpbCasX蛋白不能实现有效的基因编辑.并且基于MIDAS方法对PlmCasX蛋白的优化并不能提高其编辑活性.本研究证明了CRISPR/CasX系统在水稻中具有编辑活性,且其能识别TTCR PAM这一特性,扩大了基因编辑技术在水稻中的应用范围.