过表达碳青霉烯酶OXA-48对菌株耐药性、适应性及宿主细胞Toll样受体信号通路的影响

目的 探讨过表达OXA-48对菌株耐药性、适应性及宿主细胞Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)信号通路的影响.方法 将重组质粒pET32a(+)-OXA-48转化至E.coli BL21(DE3)中,获得的重组菌pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)进行菌落PCR及测序鉴定.以A600(0.3、0.5、0.7)、IPTG终浓度(0.4、0.6、0.8 mmol/L)及诱导时间(2、4、6 h)为变量,mRNA转录水平为响应值,设计3因素3水平正交试验,优化质粒的诱导表达条件.纸片扩散法检测重组菌pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)对亚胺培南(Imipenem,IPM)、美罗培南(Meropenem,MEM)、头孢曲松(Ceftriaxone,CRO)、头孢吡肟(Cefepime,FEP)的耐药性;通过生物膜形成试验和血清抵抗力试验检测重组菌pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)的适应性.将pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)、pET32a(+)-BL21(DE3)和E.coliBL21(DE3)菌株分别感染小鼠肺泡巨噬细胞MH-S,qRT-PCR法检测细胞中TLR2、TLR4和NF-κB(p65)基因mRNA转录水平,ELISA法检测细胞因子白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-10、肿瘤坏死因子-a(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的表达情况.结果 经菌落 PCR及测序鉴定,重组菌 pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)构建正确.最佳诱导条件:A600为0.3,IPTG终浓度为0.6mmol/L,诱导时间为2h.与pET32a(+)-BL21(DE3)菌株比较,重组菌pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)对IPM、MEM、CRO和FEP 4种抗生素的耐药性明显降低(t=7.14～22.32,P均＜0.05),形成的生物膜明显增多(t=15.69,P＜0.05),在血清中的存活率显著升高(P＜0.05);pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)感染MH-S细胞24h后,TLR2基因mRNA转录水平显著增加(t=5.77,P＜0.05),感染12及24h后,TLR4、NF-κB(p65)基因mRNA转录水平显著增加(t=3.71～10.06,P＜0.05).与正常细胞组相比较,pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)感染MH-S细胞6、12和24h后,IL-6及TNF-α的表达水平显著升高(t分别为7.90～13.44及5.40～6.32,P均＜0.01),IL-10表达水平显著下降(t=3.15～4.08,P均＜0.05),TGF-β的表达水平差异无统计学意义(t=0.013～1.41,P均＞0.05);感染12和24h时,IL-6表达水平显著高于pET32a(+)-BL21(DE3)组(t分别为2.92和3.79,P均＜0.05).结论 过表达OXA-48可降低细菌的耐药性,提高适应性及宿主细胞TLRs信号通路相关因子的转录水平,还可影响宿主细胞下游细胞因子的表达水平.