小立碗藓PpCAD4基因敲除载体的构建及功能研究

木质素是植物抵御外界环境的重要成分,肉桂醇脱氢酶(cinnamic alcohol dehydrogenase,CAD)是木质素合成途径中的关键酶和限速酶之一.前期数据表明,在灰霉菌侵染下,PpCAD4基因上调表达,但PpCAD4功能尚未明确.本次研究利用同源重组原理构建PpCAD4.1-PTN182-PpCAD4.2 敲除载体,从而破坏PpCAD4的alcohol dehydrogenase GroES-like domain(ADH N)和 zinc-binding dehydrogenase(ADH zinc N)结构域.利用PGE6000介导小立碗藓原生质体转化,筛选并鉴定得到敲除PpCAD4突变体植株.qRT-PCR表明,敲除型植株中PpCAD4的表达量相对野生型减少了 84％.通过对配子体的形态观察发现,PpCAD4突变株通过增加配子体中拟叶的数量,使得植株生物量增加,这表明CAD4在早期陆生植物的生长发育中起着重要作用.用灰霉菌侵染小立碗藓发现,0.5 d后野生型配子体菌丝入侵率为15％,cad4-ko菌丝入侵率为40％.侵染1 d后,Ppcad4-ko配子体菌丝侵入率是野生型的2倍.表明PpCAD4能够增加小立碗藓对真菌病原菌的抗性.