二十二碳六烯酸(DHA)通过PPARγ/Nrf2通路保护氧化应激对精母细胞线粒体功能及DNA损伤的作用机制

目的 探讨二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid,DHA)对精母细胞的线粒体功能及DNA损伤的影响及作用机制.方法 培养GC2 精母细胞,用不同浓度(0、50、100、200、400 μmol/L)的过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)处理2h,通过检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)确定构建氧化应激模型的最佳H2O2浓度.培养GC2 精母细胞,添加不同浓度(25、50 μmol/L)的DHA孵育24h后,再给予H2O2(200 μmol/L)处理2h,分为Control组、H2O2 组、DHA低浓度组(25 μmol/L)和DHA 高浓度组(50 μmol/L).GW9662(10 μmol/L)是过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的不可逆抑制剂,与DHA同时处理细胞.流式细胞术检测MMP,荧光酶标法检测胞内ATP含量,免疫荧光检测胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)和γ-H2AX荧光强度.逆转录-荧光定量PCR(RT-qPCR)检测过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α(PGC1α)、肉毒碱棕榈酸转移酶1α(CPT1α)、谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4)、超氧化物歧化酶2(SOD2)的mRNA水平,蛋白质免疫印迹检测PGC1α、CPT1α、磷酸化DNA复制检查点激酶1(p-CHK1)、p-p53、PPARγ及核因子NF-E2 相关因子(Nrf2)蛋白的表达变化.结果 与Control组相比,200 和400 μM浓度的H2O2 处理后,GC2 细胞的MMP显著下降(P<0.05);与H2O2 组相比,DHA低浓度组、DHA高浓度组的MMP和胞内ATP含量上升(P<0.05)、胞内ROS浓度和DNA损伤降低,PGC1α、CPT1α、GPX4、SOD2 的mRNA水平均显著上升(P<0.05),p-CHK1、p-p53 蛋白表达量显著下降,PPARγ及Nrf2 蛋白表达量显著上升(P<0.05);与DHA高浓度组相比,GW9662 组MMP、胞内ATP含量、Nrf2、PGC1α、CPT1α蛋白表达量显著降低(P<0.05),胞内ROS浓度、DNA损伤、p-CHK1、p-p53 蛋白表达量显著上升.结论 DHA可能通过上调PPARγ/Nrf2 通路来增强精母细胞的能量代谢和抗氧化作用.本研究为临床上通过多不饱和脂肪酸治疗由氧化应激导致的男性不育提供了理论依据和潜在靶点.