miR-21-5p靶向JAK/STAT信号通路抑制Th1细胞极化

目的 探讨miR-21-5p对1型辅助性T细胞(Th1细胞)极化相关信号通路的调控作用.方法 提取小鼠脾单个核细胞,用免疫磁珠阴性分选试剂盒分离初始(na?ve)CD4+ T细胞,用抗小鼠CD3ε,CD28和白细胞介素4(IL-4)单克隆抗体及小鼠IL-12和IL-2混合因子诱导体系诱导初始CD4+ T细胞向Th1细胞极化,同时转染miR-21-5p模拟物或模拟物对照,分别命名为Th1诱导组、诱导+模拟物对照组和诱导+ miR-21-5p模拟物组,72 h后用流式细胞术检测CD4和干扰素γ(IFN-γ)双阳性(CD4+IFN-γ+)细胞百分比;用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测Th1细胞极化相关关键转录因子和细胞因子mRNA表达水平;Western印迹法检测Th1细胞极化相关通路关键蛋白及其磷酸化水平.结合双荧光素酶报告系统验证miR-21-5p作用靶标关键细胞因子IFN-γ、信号通路受体IL-12受体β1(IL-12Rβ1)和信号转录与转录激活因子1(STAT1)的表达.结果 经免疫磁珠分选获得高表达CD62L的初始CD4+ T细胞.与Th1诱导组和诱导+模拟物对照组相比,诱导+miR-21-5p模拟物组CD4+IFN-γ+细胞百分比显著降低(P<0.01);Th1细胞极化相关Janus激酶(JAK)/STAT信号通路关键转录因子STAT1(P<0.01)、STAT4(P<0.05)和T盒21转录因子(T-bet)(P<0.01)mRNA表达显著下调,IFN-γ(P<0.01)和IL-12Rβ1(P<0.05)mRNA表达水平亦显著下调,同时STAT1和STAT4蛋白磷酸化水平显著降低(P<0.01).结合双荧光素酶报告系统结果表明,miR-21-5p模拟物可分别特异性靶向结合IFN-γ(P<0.01),IL-12Rβ1(P<0.01)和STAT1(P<0.05)基因的3'-非翻译区,而对应靶向位点突变后miR-21-5p模拟物不影响其表达.结论 miR-21-5p可靶向下调IFN-γ,IL-12Rβ1和STAT1表达,抑制IL-12和IFN-γ介导的JAK/STAT信号通路活化,从而抑制Th1细胞极化.