虎杖苷通过调控Keap1/Nrf2/HO-1抑制H2O2诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激和线粒体损伤

目的:探讨虎杖苷(PD)对由过氧化氢(H2O2)诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞损伤的影响及其作用机制.方法:采用SH-SY5Y细胞进行实验,细胞用不同浓度的H2O2处理24h,通过细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测细胞活力,以确定H2O2的诱导浓度.PD预处理细胞2 h后,加入H2O2诱导22 h,CCK-8法检测细胞活力,以确定PD的浓度.将细胞分为二甲基亚砜(DMSO)组、H2O2组、H2O2+PD 20μmol/L组和H2O2+PD 40μmol/L组.膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡试剂盒检测细胞凋亡,流式细胞术测定细胞内总活性氧(ROS),酶联免疫吸附测定(ELISA)检测细胞中谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量,JC-1线粒体荧光探针检测线粒体膜电位,Western blot检测B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、剪切的多腺苷二磷酸核糖聚合酶(Cleaved-PARP)、核因子E2相关因子2(Nrf2)、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)和血红素氧合酶1(HO-1)蛋白的含量.结果:①CCK-8实验结果显示,400 μmol/L浓度H2O2处理后,SH-SY5Y细胞活力为60％,故选择400 μmol/L H2O2作为后续SH-SY5Y细胞的刺激条件;20、40、50、80 μmol/L PD可显著抑制H2O2诱导的SH-SY5Y细胞活力下降(P＜0.05).②Annexin V-FITC/PI凋亡实验结果显示,20、40 μmol/L PD能够抑制H2O2诱导的SH-SY5Y细胞凋亡(P＜0.05).Western blot结果显示,20、40 μmol/L PD能够抑制H2O2诱导的SH-SY5Y细胞中凋亡相关蛋白Bax、Caspase-3表达(P＜0.05),并促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达(P＜0.05).③20、40 μmol/L PD能减少H202诱导的SH-SY5Y细胞中ROS、MDA的含量(P＜0.05),以及增加GSH、SOD含量(P＜0.05).④JC-1线粒体膜电位检测结果表明,20、40 μmol/L PD能够缓解H2O2诱导的SH-SY5Y细胞线粒体损伤.⑤Western blot结果显示,20、40 μmol/L PD能够显著抑制H202诱导的SH-SY5Y细胞中Keap1、Nrf2和HO-1蛋白水平的下调(P＜0.05).结论:PD能够减少H2O2诱导的SH-SY5Y细胞凋亡、氧化应激以及线粒体损伤,其作用机制可能与激活Keap1/Nrf2/HO-1信号通路有关.