基于分子信标技术的肉类食品动物源性成分多重筛检方法

建立一种基于通用型分子信标检测及探针熔解曲线分析技术的肉类食品动物源性成分多重筛检方法.通过对猪、牛、羊等9种常见食用畜禽动物基因组多序列比对及生物信息学分析,选取线粒体基因组16s rDNA中具有特定结构的基因片段作为检测靶序列,设计单一的通用型引物和长链分子信标.以标准基因重组载体及实体样品基因组为检测对象,确定各动物源性成分特征退火温度(Tm),建立基于实时荧光PCR及熔解曲线分析的标准检测方法,并对筛检方法的灵敏度和特异性进行考察.应用所建立检测方法,9种畜禽动物基因组扩增产物单一,测序结果与参考序列一致.对梯度稀释的猪标准基因重组载体检测发现,终浓度108～101copies/μL模板扩增Ct值范围为15～36个循环(回归系数 R2=0.99),熔解峰特征Tm为(68.0±0.1)℃.对9类畜禽肉类标准基因重组载体和实体样品进行独立检测,各类动物源性基因均形成可辨识的特异性熔解峰(Tm分别为猪68.0℃、牛64.3℃、羊65.1℃、驴65.8 ℃、马63.4℃、驼60.6℃、狗61.8℃、鸡52.6℃、鸭56.7℃),混合样品检测可见独立的种属特征熔解峰或融合形成新熔解峰.基于通用型引物及分子信标的实时荧光PCR检测方法具有理想的灵敏度和特异性,可实现对常见畜禽肉类食品源性成分的单管多重鉴定,在肉类食品源性成分筛检方面具有一定的推广应用价值.