共表达人μ阿片受体与Gq蛋白的稳定细胞株的建立及功能鉴定

建立共表达人μ阿片受体(human μ-opiate receptor,hMOR,OPRM)与Gq蛋白的CHO-FlpIn稳定细胞模型,并鉴定其药理学功能,可为体外高通量筛选靶向OPRM的药物奠定基础.该研究首先构建重组表达质粒OPRM-pcDNA5/FRT,并进行鉴定;然后通过脂质体转染法将 OPRM-pcDNA5/FRT、GqG66Di5-pIRES/puro3 和FLP重组酶质粒POG44共转染CHO-FlpIn细胞,经抗性加压和有限稀释法挑取耐药单克隆,采用FLIPR钙信号检测方法筛选阳性克隆株;最后,通过RT-qPCR对细胞中的OPRM和GqG66Di5 mRNA表达水平进行检测,并选用OPRM激动剂DAMGO和抑制剂Naloxone对稳定细胞株的药理学功能进行鉴定.结果显示:经酶切确定了重组质粒的正确构建;通过重组质粒转染、抗生素加压筛选以及钙信号测定获得22个具有活性的克隆细胞株,其中15号细胞株的荧光信号值最高,命名为Gq-OPRM1-CHO;与对照组相比,Gq-OPRM1-CHO细胞组中OPRM与GqG66Di5基因mRNA水平分别升高约400倍和120倍;在Gq-OPRM1-CHO细胞中,FLIPR钙信号检测激动剂 DAMGO 的 EC50为 0.02±0.002 μmol/L,抑制剂 Naloxone 的 IC50为 0.04±0.003 μmol/L.该研究成功建立了OPRM与GqG66Di5蛋白稳定共表达的细胞模型Gq-OPRM1-CHO,该细胞株具有对OPRM激动剂和拮抗剂特异性反应的药理学功能.