TRIM37对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制及IFN-β产生影响的研究

本实验室前期通过质谱分析筛选到宿主因子三方基序蛋白37(TRIM37),推测其可能与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的复制相关.为探究TRIM37对PRRSV复制的影响,本研究将不同剂量的PRRSV HN07-1株(MOI分别为0.01、0.1、1)分别感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)和MARC-145细胞后不同时间(6 h、12 h、24 h、36 h和48 h),采用荧光定量PCR(qPCR)检测细胞中内源TRIM37的转录水平,结果显示PRRSV能够刺激这两种细胞内源TRIM37的转录,并且PRRSV以MOI 1及感染后24 h细胞中TRIM37的转录水平最高,感染后36 h和48 h细胞中TRIM37的转录水平较感染后24 h有所下降但仍显著高于对照组(P<0.05).从MARC-145细胞中经PCR扩增TRIM37基因并克隆至pCAGGS-HA中构建真核表达质粒pCAGGS-HA-TRIM37,经双酶切及测序鉴定正确后转染MARC-145细胞,24 h后以MOI 1将HN07-1株感染细胞,感染后不同时间分别采用qPCR、western blot、病毒滴度(TCID50)测定和间接免疫荧光试验(IFA)检测PRRSV的复制情况.结果显示,与转染空载体pCAGGS-HA的对照细胞相比,过表达TRIM37后细胞中PRRSV ORF7的转录水平、N蛋白的表达水平(感染后48 h和72 h)及病毒滴度(感染后36 h与48 h)均显著(P<0.05)或者极显著(P<0.01)下降.针对TRIM37基因设计3对特异性的TRIM37 siRNA-1/2/3,转染MARC-145细胞后,利用qPCR检测TRIM37 siRNA的干扰效率,结果显示,TRIM37 siRNA-2能够有效降低TRIM37的转录水平.将TRIM37 siRNA-2转染MARC-145细胞后再以MOI 1 HN07-1株感染,感染后不同时间分别采用qPCR、western blot和病毒滴度(TCID50)测定检测PRRSV的复制情况.结果显示,与转染NC siRNA的对照细胞相比,干扰TRIM37表达的细胞中PRRSV ORF7的转录水平、N蛋白的表达水平及病毒滴度均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)升高.进一步将不同剂量的pCAGGS-HA-TRIM37与报告质粒pRL-TK-Luc和pIFN-β-Luc共转染HEK293T细胞;同时将不同剂量的pCAGGS-HA-TRIM37与报告质粒pRL-TK-Luc和pISRE-Luc共转染HEK293T细胞,18 h后加入poly(I:C)处理上述各组细胞,6 h后利用双荧光素酶试剂盒检测各组细胞中IFN-β和ISRE启动子的活性.将pCAGGS-HA-TRIM37转染HEK293T细胞,18 h后加入poly(I:C)处理细胞,6 h后采用qPCR检测细胞中相关干扰素刺激基因(ISG)(ISG15、CXCL10、MX1和OAS1)相对转录水平.双荧光素酶试验结果显示,与转染空载体的对照细胞相比,过表达TRIM37显著上调细胞中poly(I:C)激活的IFN-β和ISRE启动子的活性(P<0.05),且这种上调作用具有剂量依赖性.qPCR结果显示,与转染空载体的对照细胞相比,过表达TRIM37显著上调细胞中poly(I:C)激活的ISG15、CXCL10、MX1和OAS1 mRNA的转录水平(P<0.05).本研究首次表明TRIM37能够通过促进细胞中相应干扰素的表达抑制PRRSV复制,该结果丰富了病毒感染过程中PRRSV-宿主相互作用的网络和机制,深化了对PRRSV致病机制的认知.