豌豆蚜实时荧光定量PCR内参基因的评估

[目的]本研究旨在通过对豌豆蚜Acyrthosiphon pisum内参基因在不同实验条件下的表达稳定性进行评估,为豌豆蚜基因表达分析奠定基础.[方法]利用qPCR测定昆虫常用14种候选内参基因(EF1α,Tubulin,NADH,RPL12,SDHB,18S rRNA,28S rRNA,16S rRNA,ATPase,Actin,TATA,RPL32,GAPDH和RPL7)在豌豆蚜不同发育阶段(1-4龄若蚜和成蚜)、有翅和无翅孤雌成蚜、孤雌无翅成蚜不同组织(头、胸和腹)、不同地理种群(美国种群、甘肃种群、云南种群和德令哈种群)的孤雌无翅成蚜、不同寄主植物(苜蓿、三叶草和蚕豆)饲养的孤雌无翅成蚜、不同光周期(24L:0D,0L:24D和16L:8D)下饲养的孤雌无翅成蚜、不同温度(4,18和35℃)下饲养的孤雌无翅成蚜和吡虫啉(200 g/L)处理下孤雌无翅成蚜中的表达量;利用RefFinder,ΔCt法,GeNorm,NormFinder和BestKeeper对上述14种内参基因表达稳定性进行分析;以CYP6CY3为靶标基因,探究不同内参基因对其在吡虫啉(200 g/L)处理下孤雌无翅成蚜中表达量分析的影响.[结果]依据qPCR检测结果,通过RefFinder对ΔCt法,GeNorm,NormFinder和BestKeeper结果的综合分析显示,在不同生物条件下(发育阶段、翅型、组织、地理种群和寄主植物),18S rRNA和GAPDH是表达最稳定的内参基因,而16S rRNA和Actin的表达稳定性最差.在非生物条件下(光周期、温度和杀虫剂),18S rRNA和EF1α的表达最稳定,而Tubulin和TATA的表达稳定性最差.基于GeNorm最佳内参基因数分析和不同内参基因对靶标基因CYP6CY3表达影响的分析,推荐使用2个表达最稳定内参基因18S rRNA和EF1α用于豌豆蚜的进一步研究.[结论]在豌豆蚜qPCR分析中,推荐同时使用18S rRNA和EF1α作为内参基因.