Effect of Xianlian Jiedu Formula(仙连解毒方)on Intestinal Immune Cells in Colorectal Cancer Mice with Dampness-heat Stasis Toxin Syndrome based on Single-cell Transcriptome Sequencing
Journal of Traditional Chinese Medicine(2023)
Abstract
目的 探讨仙连解毒方治疗结直肠癌湿热瘀毒证的可能作用机制.方法 30只C57BL/6N小鼠随机分为正常组、模型组、仙连解毒方组,每组10只.模型组和仙连解毒方组小鼠采用高温高湿环境、高脂饮食与氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠联合诱导建立结直肠癌湿热瘀毒证小鼠模型.造模成功后,仙连解毒方组给予仙连解毒方12.9 g/(kg·d)灌胃,正常组、模型组给予0.2 ml生理盐水灌胃,均每周6次,连续16周.给药期间每周统计疾病活动指数(DAI)评分,末次给药后处死小鼠,检测小鼠血清二胺氧化酶(DAO)、结直肠组织髓过氧化物酶(MPO)含量,取结肠组织进行单细胞转录组测序(scRNA-seq),采用SingleR-v1.4.1,根据细胞表面标记基因,对肿瘤微环境(TME)中的免疫细胞进行细胞亚型鉴定,分析各组小鼠免疫细胞表达的差异基因的生物学功能和信号通路.结果 仙连解毒方组给药第7周至第16周,DAI评分较模型组显著降低(P<0.01).与正常组比较,模型组小鼠生存率显著降低,血清DAO、结直肠组织MPO水平显著升高(P<0.05或P<0.01);与模型组比较,仙连解毒方组小鼠生存率升高,血清DAO、结直肠组织MPO水平显著降低(P<0.05或P<0.01).scRNA-seq分析结果显示,小鼠肠道T细胞可分为CD4+T细胞、CD8+T细胞、自然杀伤(NK)T细胞、γδT细胞4种亚型.与模型组比较,仙连解毒方组小鼠肠道组织中肠上皮细胞、成纤维细胞、红系细胞数量和占比升高,B细胞、T细胞、髓系细胞数量和占比降低;T细胞中激活CD4+T细胞,效应CD4+T细胞、记忆CD8+T细胞、CD4+T细胞、γδT细胞、NK T细胞数量和占比降低,细胞毒性CD8+T细胞、耗竭CD8+T细胞数量和占比升高,CD8+T细胞、初始CD4+T细胞、记忆CD4+T细胞、调节性T细胞(Treg)、初始CD8+T细胞数量降低,占比升高;髓系细胞中各类细胞数量皆下降,其中巨噬细胞与中性粒细胞占比降低,肥大细胞、树突状细胞占比升高.差异基因富集分析显示,仙连解毒方对CD8+T细胞的调控功能主要富集在RNA聚合酶Ⅱ对转录的正向调控、转录因子激活蛋白-1(AP-1)复合物等,信号通路主要富集在破骨细胞分化、白细胞介素(IL-17)信号通路、核因子κB(NF-κB)信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路等方面;对CD4+T细胞的调控功能主要富集在伴侣辅因子依赖性蛋白质重折叠、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)级联负调控等,信号通路主要富集在炎症性肠病、破骨细胞分化、细胞凋亡、TNF信号通路等方面;对髓系细胞的调控功能主要富集在炎症反应、中性粒细胞趋化性、免疫反应等,信号通路主要富集在IL-17信号通路、TNF信号通路、NF-κB信号通路、抗原提呈加工等方面.结论 仙连解毒方可能通过调控TME中的CD8+T细胞、CD4+T细胞、γδT细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等多种免疫细胞数量和比例,干预Th1/Th2细胞分化、Th17细胞分化、IL-17、TNF、NF-κB等信号通路,改善结直肠癌免疫、炎性微环境,从而治疗结直肠癌湿热瘀毒证.
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