丹参SmRopGEF1基因的克隆、亚细胞定位与表达分析

目的:克隆丹参SmRopGEF1 基因,研究其编码蛋白的亚细胞定位及其对逆境胁迫的应激反应和激素诱导下的表达水平.方法:根据前期丹参转录组测序结果设计SmRopGEF1 基因特异引物,利用聚合酶链式反应(PCR)扩增 SmRopGEF1 基因序列;使用生物信息学方法分析 SmRopGEF1 蛋白序列特征及进化关系;构建pET28a-SmRopGEF1 原核表达载体并转化至大肠埃希氏菌中诱导表达,构建 35S启动的SmRopGEF1 的绿色荧光蛋白原生质体瞬时表达载体,利用激光共聚焦显微镜观察SmRopGEF1 的亚细胞定位;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测逆境胁迫(低温、盐及干旱)和激素诱导(生长素、脱落酸、茉莉酸甲酯)下的基因表达量.结果:丹参SmRopGEF1 基因开放阅读框(ORF)全长为 1701 bp,编码 566 个氨基酸,蛋白相对分子质量是 62 362.99.生物信息学分析显示SmRopGEF1 蛋白含有 1 个PRONE保守结构域,系统进化树分析表明SmRopGEF1 蛋白与芡欧鼠尾草和一串红RopGEF1 蛋白为高同源蛋白.成功构建pET28a-SmRopGEF1 原核表达载体并在大肠埃希氏菌Rosetta(DE3)菌株中表达、纯化出SmRopGEF1 重组蛋白.亚细胞定位的结果显示SmRopGEF1 存在于植物细胞的细胞核中.qRT-PCR 实验结果表明盐胁迫和冷胁迫能够显著提高 SmRopGEF1 的表达量;干旱胁迫后丹参愈伤中SmRopGEF1 表达量下降.茉莉酸甲酯诱导后SmRopGEF1 表达量升高.结论:克隆了丹参SmRopGEF1 基因,其在抗逆胁迫中起到重要作用并且可能参与茉莉酸甲酯信号转导.研究结果丰富了丹参防御反应机制的研究,为选育丹参抗逆优良品种、提高丹参的产量与品质提供了参考.