基于孢子壁蛋白基因靶点的虾肝肠胞虫实时荧光定量PCR体系的构建及应用

基于GenBank中公布的虾肝肠胞虫(EHP)孢子壁蛋白(spore wall protein,SWP)基因序列设计一对特异性引物,构建并优化了基于EHP-SWP靶点的SYBR实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法.试验结果显示,该引物在退火温度为60℃时具有最佳的扩增效果,扩增效率达98.8％,扩增产物的溶解曲线为1个单峰.本研究构建的qPCR体系对5.02×101～5.02×108 copies·μL-1的EHP-SWP DNA片段的检测响应有良好线性关系,扩增产物的阈值循环数(Ct)与模板起始拷贝数对数值[log(Copies)]的关系为:Ct=-0.2844 log(Copies)+10.45,(R2=0.992),检测灵敏度达5.02×101 copies·μL-1.引物特异性检测结果显示,本研究设计的检测引物仅能特异的扩增EHP模板,而对其他多种虾病原如传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、白斑综合征病毒(WSSV)、虾虹彩病毒(SHIV)、副溶血弧菌、哈维氏弧菌的扩增结果均为阴性,表明引物无交叉反应,具有良好特异性.重复性实验表明,该方法检测结果变异系数小于2％,可重复性高.应用本研究构建的检测体系对浙江海洋大学西闪岛试验基地虾塘中出现生长缓慢症状的51尾虾的EHP携带量进行检测,结果显示,EHP的感染指数与体长呈现负相关,并且,随着体长的增大,负相关性逐渐减弱.本研究为EHP的定量检测提供了一种新的具有高特异性和灵敏度的方法.