小黄鱼中杀香鱼假单胞菌实时荧光定量PCR检测技术的建立

自2015年首次实现小黄鱼全人工育种以来,小黄鱼各项养殖技术获得了长足发展,但病害防治形势依然十分严峻,其中由杀香鱼假单胞菌引发的内脏白点病是小黄鱼养殖过程中的主要病害.为准确预判该病的爆发时间并争取有效预防,建立了一种能高效、定量检测杀香鱼假单胞菌的方法.通过在小黄鱼鱼体内分离鉴定获得杀香鱼假单胞菌菌株,将其DNA回旋酶B亚基基因(gyrB)中一特异片段与pClone007 Blunt Vector载体重组得到重组质粒,后者经过转染大肠杆菌感受态细胞、LB-氨苄西林(ampicillin,AMP)选择性培养和测序鉴定,获得能表达gyrB特异片段的阳性质粒的菌落,进一步将阳性菌落进行扩大培养、质粒提取及纯化得到质粒标准品.利用设计合成的特异引物及逐级稀释的质粒标准品建立杀香鱼假单胞菌实时荧光定量PCR检测标准曲线和反应体系.通过验证,运用该技术灵敏度达到10 copies·μL-1,并且组内和组间变异系数均小于0.82％.建立的方法实现了对小黄鱼中杀香鱼假单胞菌的快速定量检测,能够精确反映该菌在养殖水体及鱼体内的季节性变化并确立其流行规律,为小黄鱼内脏白点病的早期诊断提供了准确有效工具,同时为建立小黄鱼病害预警系统提供了良好的技术支撑.