人3型副流感病毒F蛋白在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中表达的研究

目的 用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac(R) baculovirus expression systems,Bac-to-Bac BES)表达人3型副流感病毒(human parainfluenza virus type 3,HPIV-3)的重组融合蛋白(fusion protein,F),并研究密码子优化、疏水性区域、SUMOStar融合标签及gp67分泌信号肽对目的 蛋白表达的影响,同时研究F蛋白的抗原性与免疫原性.方法 全基因合成HPIV-3 F蛋白昆虫细胞密码子优化基因序列,设计特异性引物,经PCR扩增获得HPIV-3全长优化型F基因(op-F)、去除N端和C端疏水区域的截短优化型F基因(opt-F)和截短野生型F基因(wtt-F);将以上基因分别构建至pFastBac1、pI-SUMOStar、pI-secSUMOStar 3种载体,采用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统对各目的 基因对应的蛋白进行表达.利用SDS-PAGE、Western blot等方法对各目的 蛋白的表达及特异性进行检测.用纯化的重组opt-F蛋白免疫青紫蓝兔,制备F蛋白特异性抗体.结果 ①对HPIV-3的opt-F基因及wtt-F基因的表达对比显示,opt-F基因在3种载体中都得到了良好表达,而wtt-F基因在3种载体中均未表达,说明密码子优化对目的 基因的表达具有重要作用;②对HPIV-3的op-F基因及opt-F基因在pFastBac1载体中的表达对比显示,opt-F基因得到了良好表达,而op-F基因未表达,说明疏水性区域可显著影响目的 基因的表达;③对HPIV-3的opt-F基因在pFastBac1及pI-SUMOStar载体中的表达对比显示,SUMOStar融合标签可使opt-F基因的表达量明显提高;④对HPIV-3的opt-F基因在pI-SUMOStar及pI-secSUMOStar载体中的表达研究显示,添加gp67分泌信号肽后未检测到opt-F基因的可溶性表达,说明gp67信号肽对目的 蛋白无促可溶性表达效果.⑤纯化的opt-F/pI-SUMOStar蛋白免疫青紫蓝兔,得到了滴度为1∶8192的抗血清.Western blot显示,此血清可以特异性结合HPIV-3病毒的F蛋白.结论 密码子优化、N/C端疏水区域的去除以及SUMOStar融合标签的嵌合,可以显著提高F蛋白在Sf9昆虫细胞中的表达.