尼古丁通过Raf/MEK/ERK信号通路调节HepG2细胞中PCSK9的表达

目的 探讨尼古丁对前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)表达的影响以及分子机制.方法 采用不同浓度的尼古丁(0、5、10、20μmol/L)处理 HepG2 细胞 0、24、48 h,观察与低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)代谢密切相关的PCSK9的变化情况.实验分(n=3):对照组(CON组,细胞正常培养);尼古丁组(NIC组,加入10 μmol/L的尼古丁孵育24 h);尼古丁+尼古丁抑制剂组(MH组,10 μmol/L尼古丁抑制剂盐酸美加明);尼古丁+Raf抑制剂组[PLX组,1 μmol/L Raf抑制剂(PLX4720)];尼古丁+MEK抑制剂组[PD 组,1 μmol/L MEK 抑制剂(PD0325901)];尼古丁+ERK 抑制剂组[CC 组,1 μmol/L ERK 抑制剂(CC-90003)].后4组预处理l h后再加入10 μmol/L的尼古丁一起孵育24 h.采用CCK-8实验检测HepG2细胞的活性,划痕实验检测细胞迁移能力,油红0染色检测尼古丁处理后的脂质沉积.运用网络药理学筛选LDL-C与尼古丁的共同靶点和作用通路.分别使用Western blot和RT-qPCR分析PCSK9以及MAPK通路(Raf、MEK、ERK)的蛋白和mRNA的表达水平.用免疫荧光染色、酶联免疫吸附实验(ELISA)检测PCSK9蛋白的表达水平.结果 随着尼古丁浓度的升高,HepG2细胞的活性不断降低,并且相同尼古丁浓度下48 h比24 h下降更多.与CON组比较,NIC组HepG2细胞的迁移能力和脂质沉积增加(P＜0.01),而MH组相较于NIC组迁移能力和脂质沉积下降(P＜0.01).LDL-C与尼古丁的交集靶点多达257个,二者的蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction networks,PPI)核心靶点涉及MAPK通路;生物过程包含"MAPK活性的正向调节",且通路分析中的"脂质和动脉粥样硬化"富集分数最高.与CON组比较,NIC组Raf、MEK、ERK的蛋白和mRNA表达增强(P＜0.05,P＜0.01),MH组的相关蛋白和mRNA表达较NIC组明显下调(P＜0.05,P＜0.01).NIC组的PCSK9蛋白和mRNA较CON组上调(P＜0.05),MH组、PLX组、PD组和CC组的PCSK9蛋白和mRNA较NIC组下降(P＜0.05).结论 尼古丁可增加HepG2细胞脂质沉积和迁移能力,并通过Raf/MEK/ERK信号通路调节HepG2细胞中PCSK9的表达;上调的PCSK9可能是细胞内脂质沉积的重要原因.