乳酸菌素PlnJ第5位氨基酸(赖氨酸)定点突变对其热稳定性的影响

利用生物信息学软件I-Mutant2.0 分析植物乳酸菌素PlnJ的氨基酸序列,筛选出最不稳定的氨基酸位点,进行定点突变,构建点突变重组表达质粒.对点突变重组表达质粒进行原核表达,并筛选表达最适条件;采用镍亲和层析法纯化重组蛋白.以大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌作为指示菌,探究100℃水浴加热0、5、15、30 min对重组PlnJ抑菌功能的影响.结果表明,PlnJ第 3 位氨基酸——赖氨酸(AAG)对其稳定性具有重大影响.以人工合成第 5 位氨基酸,即赖氨酸(AAG)突变为缬氨酸(GTG)的PlnJ核苷酸序列作为模板,成功构建重组表达质粒,PCR和酶切鉴定结果显示目的条带 184 bp,测序后证明突变成功.重组蛋白诱导表达条件的优化结果表明:在 37℃、12 h、0.8 mmol·L-1IPTG的最优诱导条件下,特异目的蛋白表达显著(27.5 ku);咪唑洗脱液浓度 280 mmol·L-1是最优洗脱条件,可获得较为单一的目的蛋白.采用牛津杯抑菌试验法及麦氏比浊法比较突变前后的PlnJ蛋白的抑菌效果,结果表明,突变后的蛋白[PlnJ(G5)]与突变前的蛋白(PlnJ)100℃加热 0、5、15、30 min,对大肠杆菌的抑菌效果均差异显著(P<0.05),而对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑菌效果均差异极显著(P<0.01).并且,无论是否经过 30 min加热,PlnJ(G5)的抑菌效果差异均不显著(P>0.05).综上,第 5位氨基酸,即赖氨酸(AAG)突变为缬氨酸(GTG)后,PlnJ(G5)的热稳定性得到了提高,且不改变其抑菌效果.