自噬在氯化镉诱导小鼠初级精母细胞凋亡中的作用

目的 探究自噬在氯化镉(cadmium chloride,CdCl2)诱导小鼠初级精母细胞(GC-2spd)凋亡中的作用及其潜在作用机制.方法 以不同浓度CdCl2(0、5和10 μmol/L)染毒GC-2 spd细胞24 h.Hoechst33342染色法和单丹磺酰戊二胺法分别检测凋亡小体和自噬体;TUNEL荧光染色检测细胞凋亡情况;在不含/含CdCl2(10 μmol/L)的细胞培养液中分别加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(60 μmol/L)、凋亡抑制剂胱天蛋白酶家族抑制剂(50 nmol/L)、自噬激动剂雷帕霉素(50 nmol/L)和溶酶体抑制剂氯喹(10 μmol/L)处理GC-2 spd细胞24 h,Western blot检测细胞内自噬相关蛋白LC3、P62以及促凋亡蛋白cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9的表达水平.结果 CdCl2染毒细胞24 h后,自噬体聚集且凋亡细胞增多.Western blot结果显示,5和10μmol/L CdCl2染毒组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达水平与对照组(5.50±0.56)相比分别升高为9.23±0.81和12.15±0.80(P＜0.05);LC3Ⅱ蛋白表达水平与对照组(2.35±0.34)相比分别升高为 3.35±0.14 和 3.47±0.32(P＜0.05);P62 蛋白表达水平与对照组(0.83±0.09)相比分别升高为1.48±0.12和1.80±0.22;与CdCl2组相比,3-MA 处理后 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62、cleaved Caspase-9 和 cleaved Caspase-3 蛋白的表达水平分别下降为0.90±0.07(CdCl2组为1.47±0.06)、1.57±0.14(CdCl2组为2.45±0.29)、0.82±0.05(CdCl2 组为 1.44±0.18)、0.18±0.01(CdCl2 组为 0.28± 0.01)和0.61±0.84(CdCl2 组为 1.15±0.04)(P 值均＜0.05);与 CdCl2 组相比,zVAD-FMK处理后cleaved Caspase-9和cleaved Caspase-3的表达水平分别下降为0.12±0.01(CdCl2 组为 0.28±0.01)和0.34±0.01(CdCl2 组为 1.15±0.04)(P 值均＜0.05),对LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和P62的表达水平无显著影响(P值均＞0.05).与CdCl2组相比,RAPA能增强CdCl2诱导的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和P62蛋白表达水平,分别为 2.22±0.21(CdCl2 组为 1.56±0.06),3.72±0.21(CdCl2 组为 2.97±0.15)和2.41±0.19(CdCl2 组为 1.52±0.35)(P 值均＜0.05).Western blot 结果显示,与CdCl2 组比较,CdCl2与 CQ 处理组 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62 和 cleaved Caspase-3 的表达水平明显增加为 3.21±0.31(CdCl2 组为 2.09±0.25)、4.49±0.43(CdC12 组为2.72±0.26)、2.59±0.19(CdCl2组为1.84±0.19)和 2.43±0.23(CdCl2组为 1.50± 0.27)(P值均＜0.05).结论 氯化镉可能通过抑制自噬体-溶酶体融合阻滞自噬通量,促使自噬体异常聚集,诱导小鼠初级精母细胞发生凋亡.