新型冠状病毒受体结合结构域分子探针的构建及在中和抗体分离中的应用

目的 构建新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)受体结合结构域(receptor binding domain,RBD)分子探针,对新型冠状病毒感染康复者(简称"新冠康复者")的外周血单核细胞(periph-eral blood mononuclear cells,PBMCs)进行单克隆记忆B细胞分选,获得RBD特异性中和抗体.方法 从GenBank中下载SARS-CoV-2 RBD序列,在C末端加入Avi标签和6组氨酸标签后进行密码子优化设计、合成基因后克隆入表达载体pDRVI1.0,转染293F表达出蛋白进行生物素化后,利用该探针从2名新冠康复者的PBMCs中分选出单克隆RBD特异性B细胞.对B细胞裂解后,进行抗体轻重链可变区扩增,将获得的抗体轻重链基因分别克隆入表达载体,转染293F细胞后采用Protein A对抗体进行纯化,并利用SARS-CoV-2假病毒对其中和能力进行测试.结果 成功获得了 RBD-Avi蛋白,RBD-Avi探针生物素化效率达到30％～50％,Western Blot实验证实生物素化探针可以被来自于新冠康复者血浆中的抗体所识别,利用该探针可从2名新冠康复者体内成功分别分离出7个、16个RBD特异性记忆B细胞,分别占总细胞群的0.24％和0.17％;对获得的B细胞进行裂解后扩增出抗体的轻重链可变区,分别获得了 7对、12对抗体轻重链.2名新冠康复者体内共表达出16个抗体,纯化抗体后利用SARS-CoV-2假病毒进行测试,大部分抗体对假病毒都展示出 了 中和活性,其中 6个抗体的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)低于 1 μg/mL;XJ-A9和 SCF-F1针对野生型假病毒的IC50值分别达到0.07 μg/mL和0.35 μg/mL.结论 本研究构建的SARS-CoV-2 RBD分子探针具有良好的抗原性,分离的抗体具有针对SARS-CoV-2野生型假病毒的中和活性,具备深入研究的价值.