森林脑炎病毒E蛋白Domain Ⅲ的串联表达、纯化及其多克隆抗体的制备

目的 串联表达、纯化森林脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus,TBEV)E蛋白Domain Ⅲ(ED Ⅲ),并制备多克隆抗体.方法 Trizol法提取TBEV RNA,反转录为cDNA,以其为模板PCR扩增ED Ⅲ基因片段,采用重叠PCR法将2段ED Ⅲ基因片段通过疏水性柔性多肽(G4S)3连接为融合基因,与原核表达载体pET-28a(+)连接,构建重组表达质粒pET-28a-2ED Ⅲ,经测序鉴定后,转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni2+亲和层析纯化.以复性后的重组蛋白为免疫原,免疫雌性新西兰大白兔制备多克隆抗体,间接ELISA法检测效价,Western blot法鉴定特异性.利用DNAMAN软件分析TBEV与其他黄病毒ED Ⅲ氨基酸序列同源性.结果 重组质粒pET-28a-2EDⅢ经测序鉴定,扩增序列包含2段与GenBank上登录的TBEV"森张"株(JQ650523.1)E序列一致的基因,证明质粒构建正确.诱导表达的重组2ED Ⅲ蛋白相对分子质量约21 000,主要以包涵体形式存在,纯度可达97.5％.兔抗2ED Ⅲ血清多克隆抗体效价为1∶107,可与TBEV全病毒发生特异性反应.经DNAMAN软件比对,TBEV与日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)、黄热病病毒(yellow fever virus,YFV)、登革病毒(Dengue virus,DENV)ED Ⅲ氨基酸序列同源性分别为36.56％、9.28％、30.77％.结论 成功构建了TBEV ED Ⅲ串联重组表达质粒pET-28a-2ED Ⅲ,表达的重组2ED Ⅲ蛋白具有良好的反应性和免疫原性,制备的多克隆抗体效价较高.