旋毛虫鸟氨酸脱羧酶对旋毛虫抗酸能力调控的研究

为探究旋毛虫体内是否存在鸟氨酸依赖性抗酸系统(AR5)及旋毛虫鸟氨酸脱羧酶(TsODC)对旋毛虫抗酸能力的调控作用,本实验分别采用pH1.5、pH2.5、pH4.5、pH6.6的培养液以及PBS(pH7.4)作为对照组分别培养0.5 h、1h和2 h后,通过统计旋毛虫肌幼虫的存活率、采用荧光定量PCR(qPCR)和western blot,分别筛选旋毛虫肌幼虫体外最适酸处理条件.结果显示,在酸度为pH2.5培养2h时,肌幼虫的存活率为51％(此时死亡数与存活数基本相等)及TsODC基因的转录和表达水平最高.因此,pH2.5培养2 h为旋毛虫肌幼虫体外最佳酸处理条件.于培养液中分别添加不同浓度的精氨酸、TsODC多抗血清、姜黄素和雷帕霉素,以PBS作为对照组分别培养12 h、24h和48 h后,采用上述最佳酸处理条件处理后,通过计算肌幼虫存活率,采用qPCR检测TsODC基因的转录水平并初步筛选不同制剂的最佳培养浓度及时间,并在各最佳浓度和时间培养后,再经最佳酸处理条件处理,采用western blot检测TsODC蛋白的表达,分析各制剂对旋毛虫抗酸能力的调控作用;从旋毛虫感染42 d的小鼠中收集肌幼虫并采集小鼠的膈肌,分别制备冰冻切片,采用间接免疫荧光试验(IFA)检测TsODC蛋白在肌幼虫中的分布.存活率结果显示,与PBS对照组相比,当添加浓度为10 μg/mL的精氨酸培养24 h时,肌幼虫存活率提高27％,TsODC基因转录水平和蛋白表达水平分别提高83.3％和68％(P＜0.01);当添加浓度为1 mg/mL的TsODC多抗血清、20 μmol/L的姜黄素和2 μmol/L的雷帕霉素均培养48h时,肌幼虫存活率分别下降13％、18％和26％,TsODC基因转录水平分别降低24.1％、27.1％和37.7％(P＜0.01)及其蛋白表达水平分别降低11.6％、25.8％(P＜0.05)和47.8％(P＜0.01).IFA结果显示,绿色荧光信号主要出现在肌幼虫的表皮层、头部的唇乳突及尾部的生殖原基.上述结果表明,精氨酸可以通过上调TsODC基因的转录和表达水平提高旋毛虫的抗酸能力,而TsODC多抗血清、姜黄素和雷帕霉素则通过降低TsODC基因的转录和表达水平消弱旋毛虫的抗酸能力;TsODC可能是分泌蛋白且与旋毛虫的生长发育和繁殖有关.综上所述,本研究首次证实在旋毛虫肌幼虫中存在AR5,且其中的TsODC能够正调控旋毛虫的抗酸作用,为深入研究旋毛虫抗酸机制提供参考依据.