胸膜肺炎放线杆菌MnmE基因突变株的构建及其生物学特性的研究

为了探究tRNA修饰酶MnmE对胸膜肺炎放线杆菌(APP)生长特性及致病性的影响,本研究以血清7型APP S8株DNA为模板经PCR分别扩增其MnmE基因的保守结构域及全长基因,分别构建重组质粒pmnmE及pls88-MnmE,并经PCR鉴定正确后将重组质粒pmnmE通过接合转移方式导入受体菌S8中,利用氯霉素抗性筛选MnmE基因缺失株(S8ΔMnmE),并经PCR和测序鉴定;将重组质粒pls88-MnmE电转化至S8ΔMnmE感受态细胞中,经卡那抗性筛选MnmE全长基因回补株(cS8ΔMnmE),并经PCR和测序鉴定.将上述两株菌分别在无抗性培养基中传10代每代均经相应PCR鉴定其遗传稳定性.采用qRT-PCR检测MnmE基因突变对其上下游基因转录水平的影响.结果显示,突变株S8ΔMnmE和回补株cS8ΔMnmE均正确构建,且遗传稳定性均较好;qRT-PCR结果显示,S8ΔMnmE株MnmE上下游基因的转录水平均与亲本株无明显差异.通过检测不同时间点的OD600nm值并绘制生长曲线分析上述两种菌与亲本株分别在20种不同氨基酸单独缺失培养基中的生长特性;通过微量结晶紫染色法,测定3株菌在不同培养时间生物被膜(BF)的形成能力;通过测定3株菌在不同浓度H2O2中的增殖能力,分析3株菌的体外抗氧化应激能力.结果显示,S8、S8ΔMnmE及cS8ΔMnmE株在含全部20种氨基酸的化学合成培养基中的增殖速度基本一致,但在谷氨酰胺(Gln)、色氨酸(Trp)、谷氨酸(Glu)缺失时,S8ΔMnmE株的增殖水平明显低于亲本株,而在甲硫氨酸(Met)、赖氨酸(Lys)缺失时S8ΔMnmE株的生长速度快于亲本株.培养36 h、48h时各菌株BF的形成能力基本无差异,但在培养72 h时,S8ΔMnmE株BF的形成能力约为亲本株的1.5倍(P＜0.001);与S8株相比,S8ΔMnmE株经不同浓度H2O2处理后的活菌数均明显降低,且降低水平与H2O2的浓度成正比.而回补株则基本恢复了亲本株的生长特性.通过对大蜡螟的致病性试验测定S8与S8ΔMnmE的半数致死量(LD50),结果显示S8的LD50为3.16×108cfu/mL,S8ΔMnmE株的LD50为1.58×109 cfu/mL,前者比后者升高约5倍.本研究结果首次表明MnmE可参与APPBF的形成,并影响其体外抗氧化应激能力及调控APP生长,降低APP的致病性.为进一步阐明APP的致病机制提供参考依据.