小檗碱对肝癌细胞活性与增殖能力的影响及其机制

目的 探讨小檗碱(BBR)对肝癌细胞的活性与增殖能力的影响及其机制.方法 取正常人肝细胞MIHA和人肝癌细胞Hep3B、HepG2,设置对照组与0、12.5、25、50 μmol/L BBR组,采用CCK-8实验、克隆形成实验探究无糖环境下BBR对MIHA、Hep3B、HepG2细胞活性及克隆形成的影响;SYTOX 荧光染色检测细胞死亡情况;流式细胞术检测BBR孵育后肝癌细胞活性氧(ROS)水平的变化;Western blotting检测BBR孵育后Nrf2及其相关蛋白的变化;将蛋白酶体抑制剂MG132及蛋白合成抑制剂环己酰胺(CHX)与BBR共同孵育,研究其对Nrf2蛋白的影响;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测BBR孵育后Hep3B细胞的Nrf2及HO-1在基因水平的变化;于裸鼠皮下注射Hep3B细胞,构建裸鼠成瘤模型,在BBR组及对照组裸鼠腹腔分别注射BBR或等量生理盐水,观察BBR在体内对肿瘤生长的影响.HE及免疫组化染色研究在体内环境BBR对Nrf2及相关蛋白的影响.结果 无糖环境下BBR孵育后,肝癌细胞Hep3B、HepG2的活性逐渐下降(P<0.05),正常肝细胞MIHA的活性无明显变化.BBR可以抑制肝癌细胞克隆形成,促进肝癌细胞死亡,并且呈浓度依赖性(P<0.05).BBR孵育后,肝癌细胞的ROS水平增高,Nrf2、HO-1、c-Myc蛋白水平降低,而Keap1蛋白无明显变化;GSK3β基本不变,P-GSK3β(Ser9)降低,P-GSK3β(Tyr216)增高.MG132可以明显逆转BBR引起的肝癌细胞Nrf2蛋白的降低;CHX则可以增强BBR引起的肝癌细胞Nrf2蛋白的降低.BBR孵育后,Nrf2 mRNA水平增高,HO-1 mRNA水平降低(P<0.05).BBR在裸鼠体内可以明显抑制Hep3B细胞生长.注射BBR后,肿瘤组织坏死增多,肿瘤内Nrf2及c-Myc降低,而Keap1基本不变.结论 BBR可以抑制肝癌细胞的活性及增殖能力,促进其死亡;体内注射BBR后可以显著抑制肿瘤细胞生长,导致肿瘤细胞坏死增多,其作用机制可能是BBR通过非Keap1依赖的Nrf2/GSK3β通路导致Nrf2蛋白通过泛素-蛋白酶体系统降解,从而降低肿瘤细胞的抗氧化应激能力,引起肝癌细胞死亡.