共表达MEL和Ec-cLYZ重组表达质粒的构建及其重组蛋白的抑菌效果评价

为了表达一种高效低毒的广谱抑菌蛋白,试验通过T2A连接肽连接蜂毒肽(MEL)与斜带石斑鱼c型溶菌酶(Ec-cLYZ)基因,并克隆至pPICZαA质粒上构建重组表达质粒;将鉴定正确的重组表达质粒用限制性内切酶Sac Ⅰ线性化后电转化至毕赤酵母表达菌株GS115感受态细胞中,构建毕赤酵母表达菌株;利用0.5％甲醇诱导表达,收集上清液进行冻干浓缩并纯化,采用Western-blot法检测重组蛋白的表达情况,BCA蛋白浓度测定试剂盒测定重组蛋白浓度,试管二倍稀释法分别检测不同浓度重组蛋白对兔红细胞的溶血活性,牛津杯法评价重组蛋白的抑菌效果.结果表明:成功构建出重组表达质粒pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL、pPICZαA-Ec-cLYZ和pPICZαA-MEL及毕赤酵母表达菌株GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL、GS1 15/pPICZαA-Ec-cLYZ 和 GS115/pPICZαA-MEL;经甲醇诱导,GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL表达出分子质量为 16.5,3.4 ku 的重组蛋白,GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ表达出分子质量为16.5 ku的重组蛋白,GS115/pPICZαA-MEL表达出分子质量为3.4 ku的重组蛋白;上清液中重组蛋白Ec-cLYZ-MEL、Ec-cLYZ、MEL的浓度分别为35.49,28.73,27.31 mg/L;重组蛋白Ec-cLYZ-MEL、Ec-cLYZ、MEL在浓度为150 mg/L时对兔红细胞的溶血率分别为2.3％、2.9％、79.0％;停乳链球菌对重组蛋白Ec-cLYZ-MEL高度敏感,表皮葡萄球菌对重组蛋白Ec-cLYZ-MEL中度敏感,金黄色葡萄球菌和大肠杆菌对重组蛋白Ec-cLYZ-MEL低度敏感,且重组蛋白Ec-cLYZ-MEL对测试菌株的抑菌效果优于重组蛋白Ec-cLYZ和MEL.说明重组蛋白Ec-cLYZ-MEL 对红细胞无溶血活性且具有良好的抑菌活性.