不同苹果品种抗苹果绵蚜的漆酶基因表达模式及其原核表达载体筛选

[目的]明确不同苹果品种漆酶基因在抗苹果绵蚜过程中的差异表达模式,探索原核表达苹果漆酶蛋白的方法与条件.[方法]基于转录组测序分析抗蚜品种新红星(Starkrimson)、小国光(Ralls Genet)与感蚜品种红富士(Red Fuji)3个苹果品种被苹果绵蚜为害0 h、12h、5d后漆酶基因的表达模式,筛选抗蚜候选漆酶基因;选择pET-28a(+)、pET-32a(+)、pGEX-TEV、pHAT24种载体,对4个漆酶基因MdLac23、MdLac6、MdLac7、MdLac2进行原核表达,对表达产物进行Western-Blot验证,镍柱亲和层析纯化,以ABTS为底物分析其酶活性.[结果]与对照相比,不同苹果品种被害12h、5d后,苹果枝条中漆酶差异表达基因数量为27个.不同苹果品种的漆酶基因表达模式存在差异,抗蚜品种新红星及小国光漆酶差异表达基因上调表达居多,感蚜品种红富士下调表达居多,新红星12个基因上调表达,无下调表达基因;小国光9个基因上调表达,3个基因下调表达;红富士10个基因下调表达,4个基因上调表达.其中新红星特有的上调表达基因数量为6个,小国光特有的上调表达基因为5个,红富士特有的下调表达基因为9个.在16℃、0.5 mmol·L-1 IPTG,220 r·min-1诱导24h的条件下,MdLac23、MdLac2漆酶基因在pET-28a(+)载体上清液中成功表达蛋白,Western-Blot检测到清晰目的蛋白条带,与对照相比均未发现其催化活性.利用pET-32a(+)、pGEX-TEV、pHAT2载体均未在上清液中诱导出目的重组蛋白.[结论]明确了不同苹果品种漆酶基因的表达模式以及原核表达所需表达载体与条件,为进一步探索不同苹果品种漆酶抗蚜基因及其蛋白功能奠定理论与实践基础.