SIRT2去乙酰化酶活性位点突变体的构建及活性鉴定

[目的]构建人沉默信息调节因子2(silent information regulator 2,SIRT2)的去乙酰化酶活性位点突变体,并验证其去乙酰化酶活性.[方法]设计合成人SIRT2的酶活性关键位点(Q167、N168和H187)突变基因PCR引物.利用重叠延伸PCR技术,获得hSIRT2突变基因.利用分子克隆技术构建hSIRT2突变体.利用Western Blot技术检测hSIRT2突变体的表达及其去乙酰化酶活性.[结果]成功获得了 hSIRT2的168、187、167/168双位点和167/168/187三位点突变基因,片段大小为1 190 bp.所构建的突变基因重组质粒经DNA测序验证,显示成功插入.细胞内检测到清晰明确的突变体的表达信号.与野生型SIRT2相比,突变体的去乙酰化酶活性具有不同程度的改变.[结论]成功构建了hSIRT2的4种不同的去乙酰化酶活性位点突变体,其去乙酰化酶活性有不同程度降低.