雷公藤内酯三醇通过Nrf2/Keap1信号通路抑制氧化应激和炎症减轻雷公藤甲素诱导的肝损伤

目的 基于Nrf2/Keap1信号通路探讨雷公藤内酯三醇对雷公藤甲素诱导小鼠肝损伤模型的肝脏氧化应激和炎症的影响.方法 将SPF级Balb/c雄性小鼠随机分空白对照组、雷公藤甲素组及雷公藤甲素+雷公藤内酯三醇组.雷公藤内酯三醇(28mg·kg-1)灌胃预处理7d,最后1次灌胃后,单次腹腔注射雷公藤甲素(1 mg·kg-1)复制小鼠肝损伤模型.检测小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平并使用苏木素-伊红(HE)综合评估小鼠的肝损伤程度;试剂盒检测小鼠肝脏中活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)含量,观察肝脏氧化应激状态;采用ELISA试剂盒检测小鼠肝脏中白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)的水平,评估炎症反应;Western Blot法检测肝脏组织中细胞核因子-红细胞相关因子2(Nrf2)、KELCH 样 ECH 关联蛋白 l(KELCH-like ECH-associated protein 1,Keap1)、血红素氧合酶(HO-1)、醍氧化还原酶1(NQO1)的蛋白表达水平.细胞实验中,给予雷公藤内酯三醇(200μg·mL-1)及雷公藤甲素(80 ng·mL-1)干预小鼠正常肝细胞(alpha mouse liver 12,AML12)24 h,观察相关指标变化.CCK-8法确定雷公藤甲素的模型复制条件和雷公藤内酯三醇的给药浓度并观察AML12细胞的形态变化.ELISA及化学试剂盒检测AML12细胞中 IL-10、IL-6、ROS、GSH、MDA 和 SOD 的水平;Western Blot 法检测 AML12 细胞核 Nrf2、细胞 Keap1、HO-1、NQO1的蛋白表达水平.最后,使用AutoDock Vina软件对雷公藤内酯三醇及雷公藤甲素与Keap1进行分子对接观察药物靶点.结果 与雷公藤甲素组比较,雷公藤甲素+雷公藤内酯三醇组小鼠血清ALT、AST水平均明显降低(均P＜0.01);肝脏病理损伤明显改善;IL-6水平明显降低(P＜0.01),IL-10水平明显升高(P＜0.01);ROS(P＜0.05)、MDA(P＜0.01)水平明显降低,GSH(P＜0.05)、SOD(P＜0.01)水平明显升高;小鼠肝脏组织中细胞核Nrf2、HO-1、NQO1水平均明显升高(均P＜0.01).在细胞水平上,确定雷公藤甲素复制AML12细胞损伤模型的浓度为80 ng·mL-1,雷公藤内酯三醇给药浓度为200μg·mL-1;与雷公藤甲素组比较,雷公藤内酯三醇(100～400 μg·mL-1)明显提高了 AML12细胞的活力(P＜0.05,P＜0.01),明显改善了 AML12细胞的形态,AML12细胞IL-6水平明显降低(P＜0.01),IL-10水平明显升高(P＜0.05),ROS(P＜0.01)、MDA(P＜0.05)水平明显降低,GSH(P＜0.05)、SOD(P＜O.01)水平明显升高,AML12细胞中细胞核Nrf2(P＜0.01)、HO-1(P＜0.05)、NQO1(P＜0.05)水平明显升高.雷公藤内酯三醇和雷公藤甲素与Keap1结合能相当,最小结合能分别为-9.7 kJ·mol-1和-9.4kJ·mol-1.结论 雷公藤内酯三醇可以在一定程度通过抑制氧化应激和炎症反应改善雷公藤甲素诱导的肝脏损伤,其作用机制与激活Nrf2/Keap1信号通路有关.