六味地黄汤干预肾纤维化作用机制的网络药理学分析

目的 基于网络药理学方法及体内外实验探讨六味地黄汤(LWDHD)干预肾纤维化的潜在作用机制.方法 (1)通过TCMSP平台检索筛选LWDHD的活性成分及其作用靶点;通过GeneCards、OMIM、TTD数据库检索肾纤维化疾病相关靶点;利用R语言VennDiagram包对LWDHD活性成分靶点和肾纤维化疾病相关靶点取交集,得到共同(交集)靶点,即为LWDHD治疗肾纤维化的关键靶点;运用Cytoscape3.9.1软件构建LWDHD治疗肾纤维化的"活性成分-关键靶点"网络,分析核心活性成分;通过STRING平台构建共同靶点蛋白互作(PPI)网络;分别通过DAVID数据库、R语言软件的Pathview包对共同靶点进行GO功能及KEGG通路富集分析;采用AutoDock Vina软件对核心活性成分与核心靶点进行分子对接.(2)体内实验:将24只雄性SD大鼠随机分为4组:假手术组、模型组、LWDHD组(6.75g·kg-1)及依那普利组(10mg·kg-1),每组6只.采用单侧输尿管结扎术(UUO)建立肾纤维化大鼠模型.各组以相应药物灌胃给药(10mL·kg-1),每日1次,连续7 d.采用HE、MASSON染色法观察大鼠肾脏组织病理变化和胶原沉积情况.(3)体外实验:将体外培养的HK-2细胞分为正常对照组(10％空白血清)、模型组(10％空白血清+200 μmol·L-1 CoCl2)、LWDHD组(10％含药血清+200 μmol·L-1 CoCl2);采用200 μmol·L-1 CoCl2模拟肾内缺氧环境,同时加入空白或含药血清,培养24h后收集细胞;采用Western Blot法检测HK-2细胞HIF-1α蛋白表达水平.结果 (1)共得到LWDHD活性成分40个,活性成分作用靶点194个,肾纤维化疾病相关靶点5 135个、,共同(交集)靶点即LWDHD治疗肾纤维化的关键靶点159个.筛选核心活性成分主要有槲皮素、豆甾醇、山柰酚、β-谷甾醇、薯蓣皂苷元等,核心靶点有热休克蛋白90α家族A类成员1(HSP90AA1)、c-Jun氨基末端激酶(JUN)、蛋白激酶B(AKT1)及缺氧诱导因子1α(HIF-1α)等.GO功能主要与细胞因子介导信号通路、基因表达正向调控、凋亡过程负调控、缺氧反应等生物过程相关;KEGG关键通路有动脉粥样硬化、癌症途径、病毒感染、晚期糖基化终末产物-糖基化终末产物受体(AGE-RAGE)通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、白细胞介素17(IL-17)信号通路、HIF-1信号通路等.槲皮素与HSP90AA1、HIF-1α结合力中等,豆甾醇与HSP90AA1、JUNE、AKT1、HIF-1α结合力中等,薯蓣皂苷元与HIF-1α有较强的结合力.(2)体内实验显示,与假手术组比较,模型组大鼠出现肾间质炎性细胞浸润、空泡化、肾小管萎缩,部分肾小管代偿性扩张;肾组织纤维化明显,可见大量染成蓝色的胶原纤维,胶原容积分数显著升高(P＜0.01).与模型组相比,LWDHD组及依那普利组大鼠肾组织病变程度减轻,炎性细胞减少,肾小管结构损伤明显减轻;肾组织蓝色胶原纤维明显减少,纤维化程度明显减轻,胶原容积分数显著降低(P＜0.01).(3)体外实验显示,与正常对照组比较,模型组细胞HIF-1α蛋白表达水平显著升高(P＜0.01);与模型组比较,LWDHD组细胞HIF-1α蛋白表达水平明显降低(P＜0.05).结论 LWDHD治疗肾纤维化作用可能是通过槲皮素、豆甾醇、薯蓣皂苷元等多种活性成分,作用于HSP90AA1、JUNE、AKT1、HIF-1α等多靶点,通过AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路、HIF-1信号通路等多条信号通路来实现的.