波形蛋白与肝细胞癌的关系及健脾益气方的干预作用

目的:研究波形蛋白(Vimentin)与肝细胞癌(HCC)的关系及健脾益气方通过Vimentin调控肝癌的分子机制.方法:利用基于肿瘤基因组图谱计划(TCGA)和临床蛋白质组肿瘤分析协作组(CPTAC)数据库在线分析平台、STRING数据库及Cytoscape软件分析Vimentin与肝细胞癌的关系.随机将SD大鼠分为正常组、模型组、健脾益气方低、中、高剂量组(5.25、10.5、21 g·kg-1)、信号转导蛋白及转录激活子3(STAT3)抑制组(C188-9,4.5 mg·kg-1)和糖蛋白130(gp130)抑制组(SC144,4.5mg·kg-1),每组10只.除正常组外,其余各组大鼠按照70 mg·kg-1体质量腹腔注射二乙基亚硝胺(DEN)复制肝癌模型.造模成功后,正常组和模型组大鼠生理盐水灌胃,健脾益气方低、中、高剂量组分别给予对应剂量中药灌胃,2个抑制组分别腹腔注射对应抑制剂,每日1次,连续4周.末次处置后,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)法检测大鼠肝组织中Vimentin mRNA水平;比色法检测肝组织胱天蛋白酶-3(Caspase-3)酶活性;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测肝组织中Rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶1(ROCK1)、Rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶2(ROCK2)、aurora激酶B(AURKB)、锌指蛋白148(ZNF148 或者 ZBP-89)、STAT3、磷酸化 STAT3(p-STAT3)、总 Vimentin、磷酸化 Vimentin(p-Vimentin)及肝组织细胞核中Vimentin蛋白含量;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测大鼠血清中Vimentin的含量.结果:VIM mRNA在肝癌患者不同病理分期(Ⅰ～Ⅳ期)、不同病理分级(G1～G3级)、无区域淋巴结转移患者(N0)和肝癌不同亚型患者组织中表达水平均显著升高(P＜0.01);Vimentin蛋白水平在肝癌组织中显著降低(P＜0.01);VIM基因有4处突变可以导致Vimentin蛋白一级结构的改变,这些遗传突变可降低患者无病生存期(P＜0.01);VIM mRNA的表达水平与HCC纯度呈负相关(P＜0.01),而与微环境中肿瘤相关成纤维细胞、M2型巨噬细胞和髓系树突状细胞等的浸润水平呈正相关(P＜0.01).关联分析结果显示Vimentin与STAT3在HCC患者肝癌组织中的表达存在一定相关性(P＜0.01).动物实验结果显示,与正常组比较,模型组大鼠肝组织中VIM mRNA、总Vimentin、p-Vimentin和核Vimentin蛋白水平、血清中分泌型Vimentin水平、肝组织中ROCK2、AURKB、STAT3和p-STAT3蛋白水平均显著上调(P＜0.01);负调控分子ZBP-89蛋白水平显著降低(P＜0.01);Caspase-3酶活性升高、ROCK1蛋白表达水平增加,但是差异无统计学意义.STAT3抑制剂和gp130抑制剂及中、高剂量健脾益气方均可显著降低大鼠血清中分泌型Vimentin水平,肝组织中总Vimentin、p-Vimentin和核Vimentin蛋白水平,及STAT3/Vimentin信号通路主要相关分子STAT3、p-STAT3、ROCK2、AURKB的蛋白水平,上调负调控分子ZBP-89蛋白水平和Caspase-3酶活性(P＜0.05,P＜0.01),且中剂量或高剂量健脾益气方对VIM mRNA水平、STAT3蛋白、ZBP-89蛋白、ROCK2蛋白和AURKB蛋白水平,Caspase-3酶活性的干预结果,与STAT3抑制剂比较差异均不具有统计学意义.结论:Vimentin是肝癌组织中一种重要的炎症分子,其表达、细胞定位和功能可能受肿瘤相关成纤维细胞、M2型巨噬细胞和髓系树突状细胞浸润水平,以及白细胞介素(IL)-6/STAT3信号通路、特别是STAT3分子的影响;而健脾益气方可能通过干预STAT3/Vimentin信号通路调控Vimentin而防治肝癌.