SARS-CoV-2结构蛋白S和N的生物信息学比较分析及应用研究

目的 采用生物信息学方法分析新型冠状病毒(SARS-CoV-2)重要结构蛋白S和N.将S基因和N基因融合并构建重组质粒,重组质粒与骨架质粒在293T细胞中包装后获得重组腺病毒,为利用其融合基因进行疫苗研发提供理论和实验依据.方法 从NCBI 数据库中获取S、N 蛋白的基因组序列和氨基酸序列,采用生物信息学分析工具SOPMA、IEDB、BLAST、Immunomedicine Group、UniProt预测并分析S和N蛋白的理化性质、二级结构和三级结构、B细胞表位和T 细胞表位、抗原决定簇以及相互作用蛋白.分别以S-pcDNA 和N-pcDNA 质粒为模板,以S-F1、S-F2 和N-F3、和N-F4 为引物PCR扩增目的基因;通过T4 DNA连接酶连接获得S基因和N基因的融合基因,以连接后的融合基因为模板,以S-F1 和N-F4 为引物采用重叠PCR 扩增融合基因S-N.将融合基因S-N 与穿梭表达载体pDC316-mCMV-EGFP连接,获得重组质粒,然后与骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293T细胞,获得重组腺病毒.结果 S蛋白由1269 个氨基酸组成,分子式为C6325 H9752 N1654 O1886 S54,原子总数为19 671,理论等电点pI为6.35;该蛋白含有一个跨膜长度为23个氨基酸序列的跨膜螺旋(1210-1232),二级结构以无规则卷曲(占43.89％)为主,属于稳定的疏水性蛋白;N 蛋白由419 个氨基酸组成,分子式为C1976 H3150 N608 O629 S7,原子总数为6 370,理论等电点pI 为10.09;二级结构以无规则卷曲(占58.23％)为主,属于不稳定的疏水性蛋白.选择出S蛋白最具优势的抗原表位4个,选择出N蛋白最具优势的抗原表位3 个;选出S和N蛋白Th表位各2 个优势序列;选出CTL优势S蛋白表位HLA-A 2个,选出CTL优势N 蛋白表位HLA-A 3 个,HLA-B 2 个;从S蛋白抗原决定簇选择3 个优势抗原决定簇,从N蛋白选择出2个优势的抗原决定簇;获得10个与S蛋白相互作用的蛋白,6个与N蛋白相互作用的蛋白.在此基础上,成功构建了融合基因S-N重组腺病毒并HEK293T细胞中表达.结论 S和N蛋白理化性质、免疫原性、抗原决定簇及同源性等均符合疫苗的基本要求,为SARS-CoV-2 结构蛋白S和N融合基因重组疫苗的研究奠定了基础.