60Co γ射线照射的小鼠肺上皮MLE-12细胞分泌的外泌体对T淋巴细胞的活化作用

目的 探讨小鼠肺上皮MLE-12细胞(简称MLE-12细胞)受到60Coγ射线照射后分泌的外泌体介导的T细胞活化.方法 将MLE-12细胞分为对照组和60Coγ射线照射组(2、4、6和8Gy),采用超速离心法分别从其培养液的上清液中提取外泌体,应用透射电子显微镜和纳米颗粒跟踪分析技术确定外泌体的形态结构和数量特征,采用蛋白质印迹法(WB)检测外泌体中溶酶体相关膜蛋白3(CD63)、四次跨膜蛋白28(CD81)、肿瘤易感基因101蛋白(TSG101)、Ⅰ型内质网膜蛋白(Calnexin)的表达,采用流式细胞术(FCM)检测外泌体表面Ⅰ类主要组织相容性复合体(MHC Ⅰ)、Ⅱ类主要组织相容性复合体(MHC Ⅱ)、免疫调节蛋白B7-1(CD80)和免疫调节蛋白B7-2(CD86)的表达水平.将从小鼠脾脏中分离出来的初始T细胞分别与对照组MLE-12细胞(简称NC MLE-12)分泌的外泌体(简称exo/NC-MLE)、6 Gy γ射线照射组的MLE-12细胞(简称IR MLE-12)分泌的外泌体(简称exo/IR-MLE)共培养,采用FCM检测T细胞亚群CD3+、CD4+和CD8+及其活化指标T细胞特定表面糖蛋白CD28和早期活化抗原1(CD69)的变化;将初始T细胞分别与NC MLE-12、IR MLE-12和外泌体抑制剂GW4869处理组的MLE-12细胞共培养,采用FCM检测T细胞亚群CD3+、CD4+和CD8+及其活化指标CD28和CD69的变化.2组间比较采用两独立样本t检验,多组间比较采用方差分析法,组间两两比较采用Bonferroni调整法.结果 MLE-12细胞分泌的外泌体显示出典型的一面凹陷的茶托样结构,粒径为30～150nm;WB结果显示,与MLE-12细胞相比,其外泌体中特异性标志物CD63、CD81和TSG101高表达,而阴性标志物Calnexin低表达.与对照组相比,在6 Gy γ射线照射后不同时间,单个MLE-12细胞分泌的外泌体数量于24、48 h时均增加(t=5.36、6.66,均P＜0.05);在不同剂量γ射线照射后24 h,单个MLE-12细胞分泌的外泌体数量增加的现象具有剂量-效应关系,在照射剂量为6、8 Gy时,差异均有统计学意义(t=4.14、5.67,均P＜0.05).与exo/NC-MLE相比,exo/IR-MLE中MHC Ⅰ、MHC Ⅱ、CD81和TSG101的表达水平均升高.FCM结果显示,与 exo/NC-MLE 相比,exo/IR-MLE 中 MHC Ⅰ、MHC Ⅱ、CD80和 CD86 表达水平均升高(t=4.04～6.47,均P＜0.05).与 exo/NC-MLE相比,在与 exo/IR-MLE 共培养的 T 细胞中,CD3+、CD4+和CD8+T细胞均出现增殖现象(t=3.08～5.88,均P＜0.05),CD28和CD69表达水平均升高(t=3.02～8.65,均P＜0.05);外泌体抑制剂GW4869可以抑制IR MLE-12所诱导的T细胞活化(t=3.64～23.03,均P＜0.05).结论 60Coγ射线照射后的MLE-12细胞分泌的外泌体可以通过抗原呈递激活T细胞.