猪流行性腹泻病毒S1蛋白IgG抗体间接ELISA检测方法的建立

根据猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异株的S1基因序列,与pcDNA3.1载体构建重组表达质粒pcDNA-12S1,利用瞬时转染方法将pcDNA-12S1转染至293F细胞,每隔24 h取样,进行Western-blot检测,确定最佳收样时间,并采用镍离子亲和层析技术进行蛋白纯化.SDS-PAGE和Western-blot结果显示,该S1蛋白的纯度高、免疫原性好.以S1蛋白作为包被抗原,建立并优化了 IgG抗体间接ELISA方法.结果显示,S1蛋白的最佳包被浓度为0.25 μg/mL;最佳封闭剂和最佳封闭时间为5％脱脂奶粉溶液37℃作用3 h;待检血清和酶标二抗的最佳稀释度分别为1∶100和1∶20 000,最佳孵育时间均为37℃30 min.采用该方法检测猪非典型瘟病毒(APPV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪轮状病毒(PoRV)的阳性血清,结果均为阴性,表明该方法特异性好;该方法的批内和批间变异系数(CV)均＜9％,表明该方法重复性较好;该方法与间接免疫荧光(IFA)相比较,阳性符合率为93.54％,阴性符合率为94.74％,总符合率为94％.上述结果表明,该方法可用于检测临床猪血清中的PEDV抗体,为PEDV的感染与接种疫苗后的免疫保护状态监测提供有效依据.