应用CRISPR/Cas9技术构建Tet-on调控表达uPA的人源化肝细胞嵌合小鼠

目的 构建Tet-on调控小鼠肝脏特异性表达uPA基因的NOD-SCID背景的转基因小鼠,并通过人肝癌细胞移植修复小鼠亚急性肝损伤进而构建人源化肝细胞嵌合小鼠.方法 采用CRISPR/Cas9技术,在gRNA引导下,Cas9核酸内切酶于Rosa26基因位点切割并编辑,插入目的基因pTight-uPA-pA-Alb promoter-rtTA-pA表达框.使目的基因能跟随染色体稳定遗传,生物学功能保持稳定.新培育的转基因小鼠分为4组:诱导组(n=17)、移植组(n=16)、未诱导组(n=5)和空白对照组(n=5).诱导组经强力霉素诱导3周,肝脏中表达的uPA能造成小鼠肝脏亚急性损伤;再通过人肝癌细胞移植修复.移植4周后,通过小鼠血清生化学、组织病理学,评估该人源化肝细胞嵌合小鼠的效果.结果 诱导组小鼠血清中uPA、丙氨酸氨基转移酶(ALT)均高于未诱导组和空白对照组(P＜0.01);移植组人白蛋白含量显著高于未移植组(P＜0.01).组织病理学HE染色发现人肝癌细胞参与小鼠肝组织的修复,激光共聚焦显微镜观察显示鼠肝脏中有人肝癌细胞聚集并表达人白蛋白,组化染色人角质蛋白(CK18)表达成阳性.结论 新构建的转基因小鼠能通过强力霉素诱导小鼠肝脏中uPA表达,造成肝脏亚急性损伤,并通过人源肝癌细胞移植修复进而构建人源化肝细胞嵌合小鼠.