稳定高效合成多巴胺的骨髓间充质干细胞系的创建和鉴定

创建能稳定合成多巴胺(dopamine,DA)递质的三转基因(tyrosine hydroxylase/dopamine decarboxylase/GTP cyclohydrolase 1,TH/DDC/GCH1)的骨髓间充质干细胞系(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),移植至帕金森大鼠模型脑内,为帕金森病(Parkinson's disease,PD)的临床治疗提供实验依据.通过三转基因的重组慢病毒创建能稳定合成并分泌DA递质的DA-BMSCs稳定转染细胞系,利用反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western blotting)、免疫荧光等技术检测BMSCs中三转基因(TH/DDC/GCH1)的表达,采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELIS A)和高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)检测DA的合成情况.染色体G-带法检测DA-BMSCs的遗传稳定性.将DA-BMSCs移植于6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)偏侧损毁帕金森大鼠模型右脑的前脑内侧束(medial forebrain bundle,MFB)区,检测其在PD大鼠脑内微环境中的存活、分化情况.阿扑吗啡(apomorphine,APO)诱导旋转实验检测DA-BMSCs移植后PD大鼠的运动障碍改善情况.DA-BMSCs细胞系中TH/DDC/GCH1三转基因均能够稳定高效表达,而正常BMSCs对照组中均不表达.三转基因感染组(DA-BMSCs)和LV-TH感染组细胞培养上清液中DA浓度极其显著高于BMSCs空白对照组(P＜0.000 1).传代后的DA-BMSCs仍能稳定合成DA,并保持正常二倍体核型(94.5％).DA-BMSCs移植PD大鼠脑内4周后,显著改善PD大鼠模型的运动障碍,在脑内微环境中大量存活,分化为TH+和GFAP+细胞,并显著上调脑移植区域的DA水平.本研究成功创建了能稳定分泌DA,在大鼠脑中大量存活并分化的三转基因DA-BMSCs细胞系,为DA-BMSCs工程化培养与移植治疗PD奠定基础.