无花果ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为建立稳定、可靠的无花果ISSR-PCR体系以及筛选出适用于该体系的ISSR引物,本研究以无花果为研究材料,采用正交设计试验与单因素试验相结合的方法,对影响ISSR-PCR反应的5个因素(Taq聚合酶,dNTPs,DNA模板,引物,Easy Taq Buffer (Mg2+))的工作浓度进行优化.在此基础上,从UBC公布的100条ISSR引物中筛选出16条扩增条带清晰、多态性好的引物,并筛选出其最佳退火温度.试验结果表明,5个因素对无花果ISSR-PCR反应均有极显著影响,影响程度大小依次为:Easy Taq Buffer(Mg2+)＞引物＞Taq聚合酶＞DNA＞dNTPs.最终确定的最佳反应体系为:反应总体积25 μL,Taq聚合酶1.5 U,dNTPs 0.16 mmol/L,DNA 30 ng,引物0.3 μmol/L,Easy TaqBuffer (Mg2+) 3.5 μL.研究结果为今后无花果ISSR标记开发、遗传多样性研究等提供了理论依据.