酿脓链球菌特异、快速分子检测方法的建立

集中空调内部容易滋生细菌、真菌等微生物,成为有害微生物污染传播和扩散的媒介.为对公共场所空调系统有害微生物酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)进行有效检测与预防,该研究建立该菌的高效、特异的PCR检测方法和重组酶等温扩增(recombinase aided amplification,RAA)结合侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)的快速恒温检测方法.基于序列的相似性比对方法,从酿脓链球菌基因组序列中挖掘到 5个特异的DNA区段,长度分别为 5348、1098、5287、5369、240 bp.以 5369 bp的特异DNA片段为检测靶标,设计PCR引物,优化确定最优退火温度为 60.0℃;对PCR引物的特异性进行分析,确定该引物能有效区分酿脓链球菌的多个近缘种;当PCR循环数为 25、30、35 时,最低可检出 400 fg/μL(1.248×105 拷贝/μL)、4 fg/μL(1.248×103 拷贝/μL)、0.4 fg/μL(1.248×102 拷贝/μL)的模板DNA.设计RAA-LFD引物及探针,优化反应体系,确定最优反应温度为 37℃;对RAA-LFD引物及探针进行特异性分析,确定该引物能有效区分酿脓链球菌的多个近缘种;当反应时间为 5、10、15、20、25 min时,最低可检出 400 fg/μL(1.248×105 拷贝/μL)、4 fg/μL(1.248×103 拷贝/μL)、4×10-1 fg/μL(1.248×102 拷贝/μL)、4×10-2 fg/μL(1.248×101 拷贝/μL)、4×10-5 fg/μL(1.248×10-2 拷贝/μL).建立的酿脓链球菌的PCR检测体系和RAA-LFD快速检测体系特异性强、灵敏度高、快速高效,为公共场所集中空调系统有害微生物酿脓链球菌的检测、防控提供新的技术选择.