脱-γ-羧基凝血酶原蛋白的原核表达与鉴定

为实现脱-γ-羧基凝血酶原(des-γ-carboxy-prothrombin,DCP)在原核系统中高效表达,参考GenBank中发布的DCP基因CDS序列(LX095963),在保证DCP蛋白氨基酸序列正确的基础上,优化该基因的密码子;化学合成CDS序列基因,并将其融合至pET28 a(+)质粒中,构建pET28a(+)/DCP重组质粒;将该质粒转化至感受态BL21(DE3)中进行诱导表达,利用Ni柱纯化DCP蛋白,进行DCP重组蛋白纯度检测、浓度测定及蛋白印迹分析.结果表明:重组质粒在1875 bp处的双酶切条带,经测序后与已优化的基因序列完全切合.重组菌的DCP蛋白表达最高时,诱导条件为25℃、IPTG终浓度为0.8 mmol/L、时间6 h;经Ni柱纯化后的DCP重组蛋白纯度较高,浓度达1.04 mg/mL;在72 kD处有明显的蛋白条带,切合预期.在大肠杆菌系统中成功表达出DCP蛋白,为后续DCP检测方法研究提供试剂参考.