禽白血病病毒p27 蛋白多克隆抗体的制备及POCT检测方法的建立

旨在制备禽白血病病毒p27 蛋白多克隆抗体和建立一种简便准确的禽白血病病毒的检测方法,通过扩增禽白血病病毒p27 目的基因,构建pGEX-6p-1-p27、pET-32a-p27 蛋白原核表达载体.将蛋白分别免疫BALB/c小鼠和新西兰白兔,制备鼠源多克隆抗体和兔源多克隆抗体,制备鼠源多克隆抗体偶联荧光微球,利用三维喷点平台将鼠源多克隆抗体IgG喷涂到样品垫;用划膜仪将纯化后的兔源多克隆抗体IgG和山羊抗兔抗体稀释液划到NC膜上,作为T线和C线,进行试纸条的组装,初步建立了即时检验荧光微球免疫层析检测ALV试纸法,并用POCT试纸条检测临床阳性样本.结果表明:成功构建pGEX-6p-1-p27、pET-32a-p27 蛋白原核载体并诱导p27 重组蛋白表达.将纯化后的p27 融合蛋白与佐剂等容量混合后作为免疫原免疫BALB/c小鼠和新西兰白兔,成功制备出p27 蛋白的鼠源和兔源多克隆抗体,通过血清效价以及Western Blot鉴定显示多抗的免疫原反应良好.荧光微球偶联鼠源多克隆抗体的最适pH值为6.2.POCT试纸条检测结果显示,ALV的阳性样品与荧光微球包被的鼠源多克隆抗体结合良好,T/C数据比其他样本高,且仅有阳性样本和荧光微球包被的鼠源多克隆抗体结合后,在紫外灯的照射下,C线(质控线)和T线(检测线)才均会有荧光条带,与临床诊断结果相符.试验建立的POCT荧光微球免疫层析检测ALV的方法,可为禽白血病病毒的检测提供一种更为简便的方法,为基层兽医临床检测提供便利.