牛筋草EPSPS酶联免疫试剂盒的研发及应用

[目的]克隆牛筋草(Eleusine indica)中草甘膦的靶标基因EPSPS,获得牛筋草EPSPS重组蛋白并制备其单克隆及多克隆抗体,组装酶联免疫试剂盒,检测牛筋草植株不同组织EPSPS的表达水平及蛋白含量,为快速鉴定抗性牛筋草提供简便工具.[方法]利用PCR方法克隆EPSPS基因全长;构建pET30a-EPSPS阳性质粒并转化宿主菌BL21,经IPTG诱导表达后获得重组蛋白;利用该重组蛋白免疫小鼠与新西兰大白兔,制备单克隆及多克隆抗体,并利用Western blot检测特异性;利用间接ELISA方法进行免疫配对试验,筛选出最佳配对抗体,优选各试剂工作浓度并组装试剂盒;用研制的试剂盒对不同种群牛筋草进行EPSPS含量检测,并与qPCR结果分析比较.[结果]牛筋草EPSPS的开放阅读框含有1 620 bp的核苷酸,编码540个氨基酸,理论等电点为8.80,该蛋白无跨膜区域.进化树分析结果表明牛筋草EPSPS与水稻EPSPS进化关系最近.诱导蛋白表达的培养条件为1mmol·L-1的IPTG,25℃,获得了纯度大于90％,浓度为3 mg·mL-1的重组蛋白12 mg;编号为R1711和R1712的家兔免疫后产生的多克隆抗体有较高的效价,编号为M171070,M171071、M171072的小鼠产生的单克隆抗体效价较高.进一步筛选出单抗FL-374-08能与多克隆抗体组成最佳配对抗体;酶联免疫试剂盒包被抗体的最优质量工作浓度为2 μg·mL-1,酶标抗体的最优工作浓度为10 μg·mL-1;试剂盒线性检测范围为5-80 μg·kg-1,检出限为5 μg·kg-1.抗性牛筋草植株叶片中EPSPS的表达量是敏感植株的52.9倍,而茎中EPSPS的表达量是敏感植株的63.0倍.在抗性牛筋草叶片中EPSPS相对拷贝数是敏感植株的53.5倍,而茎中EPSPS的相对拷贝数是敏感植株的78.6倍.Western blot结果表明单抗与牛筋草EPSPS有特异性免疫,并能准确区分不同敏感性植株及不同组织的蛋白含量差异.酶联免疫检测结果发现抗性牛筋草茎中的EPSPS浓度可以达到6.0 μg·L-1,而敏感植株叶片和茎中EPSPS蛋白的浓度分别为0.22和0.43 μg·L-1.[结论]获得的牛筋草EPSPS单克隆抗体特异性强、灵敏度高,研发的EPSPS酶联免疫试剂盒能够快速、准确检测牛筋草EPSPS蛋白含量并鉴定牛筋草由EPSPS过量表达导致的草甘膦抗药性.