乙型肝炎病毒X蛋白促进磷脂酶A 2受体表达加重足细胞焦亡的机制

目的:探讨乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）诱导足细胞膜上M型磷脂酶A 2受体（PLA 2R）表达增加对乙型肝炎病毒相关性肾炎（HBV-GN）中足细胞焦亡的影响及其作用机制。 方法:采用转染HBx基因至人肾脏足细胞内的方法模拟HBV-GN发病过程，并将足细胞分为以下8组：正常对照+分泌型磷脂酶A 2-ⅠB（sPLA 2-ⅠB）组、空白质粒+sPLA 2-ⅠB组、HBx组、HBx+sPLA 2-ⅠB组、HBx+sPLA 2-ⅠB+PLA 2R对照siRNA组、HBx+sPLA 2-ⅠB+PLA 2R-siRNA组、HBx+sPLA 2-ⅠB+ROS对照siRNA组及HBx+sPLA 2-ⅠB+ROS-siRNA组。电镜下观察足细胞形态，荧光显微镜下利用免疫荧光染色观察足细胞膜上PLA 2R的表达，流式细胞术分析足细胞焦亡率及活性氧（ROS）表达，实时荧光定量PCR及Western 印迹测定PLA 2R、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、胱天蛋白酶1（caspase-1）、白细胞介素（IL）-1β及IL-18 mRNA及蛋白的表达情况。 结果:与正常对照组相比，体外转染HBx质粒后足细胞膜上M型PLA 2R表达增加（4.07±0.41比1.01±0.17， P<0.001），电镜及胱天蛋白酶荧光染料抑制物/碘化丙啶（FLICA/PI）双染细胞焦亡检测提示过表达的PLA 2R与其配体sPLA 2-ⅠB结合后足细胞损伤加重，焦亡程度增加（20.22%±0.36%比7.86%±0.28%， P<0.001），且PLA 2R过表达时ROS（4 324 515±222 764比12 920±46， P<0.001）、NLRP3（48.30±2.73比1.00±0.11， P<0.001）、ASC（4.02±0.84比1.01±0.15， P<0.001）、caspase-1（3.99±0.42比1.00±0.11， P<0.001）、IL-1β（9.08±0.75比1.00±0.09， P<0.001）及IL-18（19.20±0.70比1.00±0.02， P<0.001）表达水平增加。相反，加入PLA 2R-siRNA或ROS-siRNA敲低相关物质表达后，足细胞损伤减轻，焦亡程度下降，下游信号通路相关基因NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β及IL-18基因表达均减少（均 P<0.01）。 结论:HBx可能通过上调PLA 2R靶向ROS-NLRP3信号通路促进HBV-GN中足细胞焦亡。