miR-96-5p靶向IRS1对麦芽酚铝致PC12细胞凋亡的影响

目的:探讨miR-96-5p在麦芽酚铝致PC12细胞凋亡中的影响及其作用机制。方法:于2021年1月，取对数生长期的PC12细胞，分为空白对照组和低、中、高剂量组，分别采用0、100、200、400 μmol/L的麦芽酚铝处理24 h，收集各组细胞，采用流式细胞术检测细胞凋亡率，qRT-PCR检测miR-96-5p和胰岛素受体底物1（IRS1）mRNA表达水平，Western blotting检测半胱氨酸蛋白酶3（Caspase3）、活化型半胱氨酸蛋白酶3（Cleaved-caspase3）、IRS1、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）、磷酸化葡萄糖合成激酶3β（p-GSK3β）蛋白表达水平。双荧光素酶报告基因实验检测miR-96-5p和IRS1的靶向结合关系。采用miR-96-5p inhibitor转染PC12细胞24 h构建miR-96-5p抑制细胞和阴性对照细胞，将细胞分为空白对照组、阴性对照组、铝染毒组、铝染毒+阴性对照组、铝染毒+miR-96-5p抑制组、miR-96-5p抑制组，采用miR-96-5p inhibitor和IRS1 siRNA转染PC12细胞24 h后将细胞分为铝染毒+miR-96-5p抑制+阴性对照组和铝染毒+miR-96-5p抑制+IRS1抑制组，对照组细胞用完全培养基培养，染毒组细胞采用200 μmol/L麦芽酚铝处理24 h，收集各组细胞，检测细胞凋亡率、miR-96-5p和IRS1 mRNA表达水平以及Caspase3、Cleaved-caspase3、IRS1、p-AKT、p-GSK3β蛋白表达水平。结果:染毒24 h后，与空白对照组和低剂量组比较，中、高剂量组PC12细胞的凋亡率、Caspase3和Cleaved-caspase3蛋白相对表达量，以及miR-96-5p相对表达量均明显升高，IRS1 mRNA相对表达量明显下降，IRS1、p-AKT和p-GSK3β蛋白相对表达量明显下降（ P<0.05）。Targetscan预测和双荧光素酶报告实验均证明IRS1是miR-96-5p的直接靶基因。在转染实验中，与铝染毒组比较，铝染毒+miR-96-5p抑制组PC12细胞凋亡率以及Caspase3和Cleaved-caspase3蛋白相对表达量均下降，miR-96-5p的相对表达量明显下降，IRS1 mRNA和IRS1、p-AKT、p-GSK3β蛋白的相对表达量均升高（ P<0.05）。在IRS1低表达实验中，与铝染毒+miR-96-5p抑制+阴性对照组比较，铝染毒+miR-96-5p抑制+IRS1抑制组中PC12细胞凋亡率、Caspase3和Cleaved-caspase3蛋白相对表达量明显增加，IRS1 mRNA相对表达量以及IRS1、p-AKT和p-GSK3β蛋白相对表达量明显下降（ P<0.05）。 结论:miR-96-5p表达增加从而靶向抑制IRS1可能是麦芽酚铝染毒导致PC12细胞凋亡的机制之一。