1,25(OH)2D3及VDR敲除对山羊附睾头上皮细胞β防御素家族表达的影响

旨在研究1,25(OH)2D3是否通过VDR途径调节山羊附睾头上皮细胞β防御素基因表达.本试验选取3只6月龄太行黑山羊,分别采集附睾头组织.采用差速贴壁法分离山羊附睾头上皮细胞,用细胞免疫荧光鉴定上皮细胞纯度.添加100 nmol·L-1 1,25(OH)2D3处理附睾头上皮细胞以及筛选出敲除效率最高的pCas9/gRNA1质粒载体进行细胞转染,同时设置阴性对照组和空白对照组,每组3个重复孔.附睾头上皮细胞经1,25(OH)2D3处理以及VDR基因敲除后,分别用qRT-PCR检测VDR和17种β防御素基因的表达,用Western blot检测VDR蛋白和3种β防御素蛋白的表达.结果表明,1,25(OH)2D3能极显著提高VDR、gBD124、gBD126和gBD104a的mR-NA 和蛋白表达(P＜0.01),同时极显 著提高 gBD 104、gBD 109tr1、gBD 109tr2,gBD 113、gBD 116、gBD 120,gBD121以及gBD123基因的表达(P＜0.01),显著提高gBD106、gBD127、gBD129以及gBD134基因的表达(P＜0.05),而对gBD110like和gBD128基因没有显著影响(P＞0.05);3个基因敲除载体进行细胞转染后,pCas9-VDR-V1组VDR蛋白表达极显著降低(P＜0.01).VDR基因敲除极显著降低gBD124的mRNA和蛋白表达(P＜0.01),显著降低gBD126和gBD104a的mRNA和蛋白表达(P＜0.05),同时VDR基因敲除组gBD109tr1、gBD109tr2、gBD116、gBD123、gBD127、gBD128 以及 gBD134 基因的表达极显著低于其他组(P＜0.01),VDR基因敲除组gBD104、gBD106、gBD120以及gBD129基因的表达显著低于其他组(P＜0.05),而对gBD121、gBD110like以及gBD113的相对表达则无显著影响(P＞0.05).综上所述,1,25(OH)2D3可以上调VDR和部分β防御素表达;VDR基因敲除后降低部分β防御素表达,结果表明1,25(OH)2D3通过上调VD/VDR信号通路关键基因VDR的表达调控山羊附睾头上皮细胞部分β防御素表达.